臺灣博碩士論文加值系統

本研究利用表面增強拉曼散射光譜（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS）高靈敏度和高解析度的特性來偵測微量DNA及carbazole 的衍生物。實驗以銀奈米粒子（平均直徑34 nm）做表面增強拉曼散射的基質。但製備的銀奈米粒子表面帶有負電荷，會與DNA骨架上的磷酸根相斥，故使用帶正電的多胺分子spermine4+來中和電荷，藉以誘導DNA的吸附及促進銀奈米粒子的聚集。實驗證實DNA分子是以骨架與銀金屬作用，如此可成打o微量DNA的表面增強拉曼散射訊號，偵測極限更可達到1μg/mL。spermine並與NaCl、KCl及MgSO4等鹽類比較，以建立電中和劑與DNA的作用模型。
此外，3,6-Bis(1-methyl-4-vinylpyridinium) carbazole diiodide (BMVC)為新合成的化學物期望能達到穩定DNA端粒G-四角結構以抑制端粒酶的作用。抑制癌症細胞之化合物，初步研究指出它與DNA G-四角結構有強作用力；我們偵測其表面增強拉曼光譜配合B3LYP/6-31G*的計算方式來探討此化合物與銀的吸附方式，結果發現BMVC主要是1-Methyl-4- vinylpyridinium上帶正電荷之氮原子透過碘離子吸附在銀表面，carbazole部分則是較遠離銀金屬表面。
最後我們利用表面增強拉曼光譜的技術偵測DNA分子與BMVC間的作用，由差異光譜發現BMVC可能是以carbazole部分與DNA分子作用，相信此實驗結果將有助於DNA分子與BMVC間作用方式進一步的研究探討。

Surface enhanced Raman scattering (SERS) could be a useful technique for DNA detection since it is a rapid, sensitive and molecularly specific method. We have worked on finding the best charge neutralizer to improve the detection limit of DNA by SERS.
This study demonstrates that the quadruvalent cation spermine can be used to generate reproducible and sensitive SERS spectra of oligonulceotides. The detection limit of DNA reaches to 1μg/mL. In addition, we also compare spermine with metal salts such as NaCl , KCl and MgSO4, and discuss the interaction among DNA, nanoparticles, and charge neutralizer.
3,6-Bis(1-methyl-4-vinylpyridinium) carbazole diiodide (BMVC) is a potential anticancer drug. According to SERS study and the quantum calculations of the molecular vibrational modes using B3LYP/6-31G*, we suggest that BMVC adsorbed on the silver surface by two end parts which are 1-Methyl-4-vinylpyridinium(4MVP).
At last, we studied interactions between BMVC and DNA. The experiments suggest that carbazole part of BMVC to interact with DNA.

中文摘要…………………………………………,…………………………Ⅰ
英文摘要……………………………………………,………………………Ⅱ
目錄…………………………………………………,………………………Ⅲ
圖目錄………………………………………………………,………………Ⅴ
表目錄……………………………………………………………………….Ⅷ
第一章 前言
1-1 去氧核醣核酸(DNA)的二級結構雙螺旋結構的模型……………………………………………......................................1

1-2 變性與復性…………………………………………..……………...7
1-3 精氨…..……………………………………………………..……….7
1-4 端粒………………………………………………………………….8
1-5 藥物…………………………………………………………………11
1-6 實驗動機……………………………………………………………13
第二章 實驗基本原理
2-1 拉曼散射………………………………………………….………..…14
2-2 共振拉曼散射……………………………………………………..….18
2-3 表面增強拉曼散射……………………………………………..…….19
2-4 表面增強拉曼的機制………………………………………..……….21
2-4-1 物理增強……………………………………………...…….……...21
2-4-2 化學增強…………………………………………….......…….…...22
2-5 拉曼光譜儀………………………………………….......………...….24
2-5-1 雷射光源…………………………………………...….…………...24
2-5-2 分光儀…...…………………………...………….......…….….……24
2-5-3 CCD（Charge-Coupled Device）感測元件……………..………..26
第三章 實驗步驟
3-1 銀膠體溶液………………………………………………………….27
3-2 實驗藥品…………………………………………………………….27
3-3 實驗儀器架設……………………………………………………….29
第四章 結果與討論
4-1 DNA振動頻率的標示………………………………….……………….31
4-2 BMVC振動頻率的標示………………………………………………..39
4-3 利用表面增強拉曼光譜的差異判別BMVC與DNA作用的情形…...42
第五章 結論……………………………………………………………….43
參考文獻…………………………………………………………………….59
















圖目錄
圖1-1.1表示鹼基的結構與作用方式。……………..…………………..........1
圖1-1.2表示DNA的複製方向。………...……………………………….…2
圖1-1.3表示B-DNA的結構。………………………………………………..3
圖1-1.4表示DNA多種型態結構。…………………………………………..3
圖1-1.5表示DNA上五碳醣不同型態的結構。…………………………….4
圖1-3.1為三種多胺分子的結構。……………………………………………7
圖1-4.1染色體位於細胞核內，它是經由DNA以特殊的方式纏繞所組成，在染色體尾端的DNA，稱為端粒。………………………………………..9
圖1-4.2 DNA端粒中單股的序列利用RNA模板及端粒酶的配合，可以達到端粒增長的目的。……………………………………………………...…10
圖1-5.1四角結構。…………………………………………………………..11
圖1-5.2 PIPER分子結構。………………………………………………......12
圖1-5.3表核磁共振儀（NMR）四角結構d(TAGGGTTA)4與有機分子PIPER的複合物。…………….……………………………………………...12
圖2-1.1 拉曼散射圖。………………………………………………….…...15
圖2-1.2 是以488 nm雷射所激發CCl4的拉曼光譜。……………………...16
圖2-1.3 拉曼散射與螢光光譜圖。………………………………………....18
圖2-2.1共振拉曼散射能階圖。…………………………………….……….19
圖2-3.1 比較一般拉曼與SERS。……………………………………….….20
圖2-4-1.1 SERS電磁場增強效應簡圖。…………………………………....21
圖2-4-2.1典型的分子與金屬系統的能階圖。……………………………..23
圖2-5.1 拉曼光譜分析儀器的組件。………………………………………24
圖2-5-2.1 光柵的多狹縫干涉。…………………………………...………..25
圖2-5-2.2 單色儀示意圖。………………………………………………….25
圖3-2.1 四種具有G quadruplex結構的DNA。…………………………....28
圖3-3.1 表面增強拉曼實驗儀器架設圖。………………………………..29
圖4-1.1各種不同陽離子作為聚集劑的LD雙股螺旋DNA的表面增強拉曼圖譜的比較。……………………………………………………………..31
圖4-1.2不同濃度spermine的表面增強拉曼圖譜。………………….…….32
圖4-1.3表不同結構的DNA表面增強拉曼光譜圖。………………………37
圖4-1.4使用Lorentzian四個波所fitting的結果。……………………….....38
圖4-1.5是DNA吸附在銀金屬表面的情形。…………………………..…..40
圖4-1.6比較單股跟雙股DNA的表面增強拉曼圖譜。………….………...42
圖4-1.7 DNA 與 spermine 的作用模型。………………………………....43
圖4-2.1為carbazole 分子的拉曼光譜圖。………………………………….44
圖4-2.2carbazole 分子理論計算拉曼光譜與實驗的表強拉曼光譜圖。….46
圖4-2.3表示carbazole 分子1622cm-1的振動模式。…………...………….46
圖4-2.4表示4MVP分子理論拉曼光譜與實驗的表面增強拉曼光譜。…..47
圖4-2.5由理論計算4MVP分子後，所得的振動頻率與相對應的振動模式。…………………………………………………………………………...48
圖4-2.6為BMVC分子與4MVP分子的表面增強拉曼圖與carbazole 分子理論計算拉曼光譜。………………………………………………………...49
圖4-2.7為三種carbazole衍生物的結構。………………………………….50
圖4-2.8為三種carbazole衍生物的表面增強拉曼光譜圖。……………….51
圖4-2.9為1-methyl-2-vinylpyridinium (2MVP)，1-methyl-4-vinylpyridinium (4MVP)和1-methyl-3-vinylpyrazinium (3NMVP)的理論計算光譜圖。…..52
圖4-2.10表BMVC分子吸附在銀金屬表面上的情形。…………………53
圖4-3.1是LD10-6M與BMVC10-9M的作用光譜圖。……………………...54
圖4-3.2是不同DNA10-6M與BMVC5X10-9M的作用光譜圖。………….54
圖4-3.3是不同DNA10-6M與BMVC5X10-9M的作用光譜圖。………….55
圖4-3.4是LD 10-6 M與BMVC 5X10-9 M的差異光譜圖。………………....56
圖4-3.5是GC 10-6 M與BMVC 5X10-9 M的差異光譜圖。……….…….….56
圖4-3.6是AT 10-6 M與BMVC 5X10-9 M的差異光譜圖。……………….57











表目錄
表1-1.是DNA不同型態的各項結構值。…………………………….………5
表4-1.1 表LD的振動波峰與文獻值比較。………………………………..47
表4-1.2 使用Lorentzian公式所fitting的DNA波峰位置。……………….48
表4-2.1 carbazole 分子理論計算與實驗的拉曼頻率比。…………………50
表4-2.2文獻的scale factor。………………………………………………51
表4-2.3 4MVP分子理論計算與實驗的拉曼頻率比。……………...……53

1. Rich, A., Quigley, G. J.,; Wang, A. H.-J. Biomolecular 1981, pp 35-52
Stereodynamics (Sarma, R. H., Ed.), Adenine, Albany, NY.
2. Shakked, D.; Rabinovich, D.; Kennard, O.; Cruse, W. B. T.; Salisbury, S. A.; Viswamitra, M. A. J. Mol. Biol. 1983, 166, 183.
3. Wang, A. H.-J.; Quigley, G. J.; Kolpak, G.; van der Marel,J. H.; van Boom, J. H.; Rich, A. Science 1980, 211, 171.
4. Drew, H. R.; Wing, R. M.; Takana, T.; Broka, T.; Tanaka, S.; Itakura, K.;Dickerson, R. E. Proc. Natl. Acad. Sci. 1981, 78, 2179.
5. Milane, R. P.; Walker, J. K.; Arnott, S.; Chandrasekaran, R.; Birdsall, D. L. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 5475.
6. Englander, S. W.; Kallenbach, N. Q. Rev. Biophys. 1983, 16, 521.
7. Mirau, P. A.; Kearns, D. R. Biopolymers. 1985, 24, 71 1..
8. Wartell, R. M.; Benight, A. S. Biopolymers. 1982 21, 2069.
9. Klysik, J.; Stirdivant, S.; Larson, J. E.; Hart, P. A.; Wells, R. D. Nature. 1981, 290, 671.
10. Wartell, R. M.; Benight, A. S. Biopolymers. 1982, 21, 2069.
11. Klysik, J.; Stirdivant, S.; Larson, J. E.; Hart, P. A.; Wells, R. D. Nature. 1981, 290, 671.
12. Hagerman, P. Biopolymers. 1981, 20, 1503.
13. Shore, D.; Baldwin, R. L. J. Mol. Biol. 1983, 170, 957.
14. Horowitz, D. S.; Wang, J. C. J. Mol. Biol. 1984, 173, 75.
15. Reid, D. G.; Salisbury, S. A.; Bellard, S.; Shakked, Z.;Williams,D.H. Biochemistry. 1983, 22, 2019.
16. Sarma, M. H.; Gupta, G.,; Sarma, R. H. J. Biomol. Struct. Dyn. 1985, 2, 1057.
17. Lord, R. C.; Thomas, G. J. Jr.; Spectrochim. Acta, Part A 1967, 23A, 2551.
18. Thomas, G. J., Jr.; Kyogoku, Y. Pract. Spectrosc. 1977, IC, 717.
19. Nishimura, Y.; Hirakawa, A. Y.; Tsuboi, M. Adu. Infrared Raman Spectrosc. 1978, 5, 217.
20. Nishimura, Y.; Tsuboi, M.; Sato, T. Nucleic AcidsRes. 1984, 12, 6901.
21. Wartell, R. M. ; Harrell, J. T. Biochemistry. 1986, 25, 2664-2671
22. Benevides, J.M.; Wang, A. H.-J.; van der Marel, G.A.; van Boom, J.H.; Thomas, Jr., G.J. Biochem. 1988, 27, 931-938.
23. Dostal, L.; Chen, C.-Y.; Wang, A. H.-J.; Welfle, H. Biochem. 2004, 43, 9600-9609.
24. Creighton, J.A.; Blatchford, C.G.; Albrecht, M.G. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1979, 75, 790.
25. Lee, P.C.; Meisel, D. J. Phys. Chem. 1982, 86, 3391-3395.
26. Leopold, N.; Lendl, B. J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 5723-5727.
27. Graham, D.; Smith, W.E.; Linacre, A.M.T.; Munro, C.H.; Watson, N.D.; White, P.C. Anal. Chem. 1997, 69, 4703-4707.
28. Munro, C.H.; Smith, W.E.; Garner, M.; Clarkson, J.; White, P.C. Langmuir. 1995, 11, 3712-3720.
29. Graham, D.; Mallinder, B.J.; Smith, W. E. Biopolymers. 2000, 57, 85-91.
30. Kneipp, K.; Flemming, J. J. Mol. Struc. 1986, 145, 173-179.
31. Kneipp, K.; Pohle, W.; Fabian, H. J. Mol. Struc. 1991, 44, 183-192.
32. Mitchell, J. L.; Leyser, A.; Holtorff , M. S. Biochem J, 2002, 366, 663-671.
33. Monti, M. G.; Pernecco, L.; Manfredini, R.Life Science.,1996, 58(23), 2065-2072.
34. Slaga ,J. J.; Nelson, K. G. Multistage skin tumor promotion in mouse skin:critical protein changes during tumor promotion. In:Gene and protein in oncogenesis, edited byI B Weinstein and H J Vogel Academic press, New york.1983,125-142.
35. Stewart,T. M.; Wang, Y. Devereux, W. Biochem J, 2002, 368, 673-677.
36. 自然細胞生物學(2002 )
37. Williamson, J.R.; Raghuraman, M.K.; Cech, T.R., Cell. 1989, 59, 871-880.
38. Fedoroff, O. et al. Biochemistry 1998, 37, 12367–12374.
39. Han, H. et al. Biochemistry, 1999, 38, 6981–6986.
40. Ferraro, J. R. Introductory Raman Spectroscopy (New York: Academic) 1994
41. Fleischman, M.; Hendra, P.J.; McQuillan, A.J., Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 123.
42. Kneipp K.; Kneipp H.; Itzkan I.; Dasari R.R.; Feld M., J. Phys.: Condens. Matter 2002, 14, R597-R624.
43. Seki, H. J. J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom. 1986, 39, 239.
44. Moskovits, M. Rev. Mod. Phys. 1985, 57, 783-826.
45. Baron, M. H.; Grajcar, L., J. Raman Spectrosc. 2001, 32, 912-918.
46. Kneipp, K.; Hinzmann, G.; Fassler, D., Chem. Phys. Lett. 1983, 99, 5.
47. Pettinger, B.; Krischer, K., J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom. 1987, 45, 133.
48. Kerker, M.; Siiman, O.; Bumm, L. A.; Wang, D. S. Appl. Opt.1980, 19, 3253.
49. Wang, D. S. ; Kerker, M. Phys. Rev. B. 1981, 24, 1777.
50. Zeman, E. J.; Schatz, G. C. J. Phys. Chem. 1987, 91, 634.
51. El-Sayed, M. A. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 257-264.
52. Kelly, K. L.; Coronado, E.; Zhao, L. L.; Schatz, G. C. J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 668-677.
53. Xu, H. X.; Aizpurua, J.; Kall, M.; Apell, P. Phys. Rev. 2000, E 62, 4318.
54. Otto A, Mrozek I, Grabhorn H and Akemann W 1992 J. Phys.: Condens. Matter 4 1143.
55. Campion, A.; Kambhampati, P. Chem. Soc. Rev. 1998, 27, 241.
56. Jiang, J. D.; Burstein, E. ; Kobayashi, H. Phys. Rev. Lett. 1986, 57, 1793.
57. Arenas, J. F.; Woolley, M. S.; Tocon, I. L.; Otero, J. C. ; Marcos, J. I. J. Chem. Phys. 2000, 112, 7669.
58. Creighton, J.A.; Clark, R.H.J.; Hester, R. E. Chicheste, Eds. Wiley. "Spectroscopy of Surfaces", 1988, p.37-89.
59. Otto, A. Phys. Status Solidi. 2001, 188, 1455.
60. Hildebrandt, P.; Stockburger, M., J. Phys. Chem. 1984, 88, 5935.
61. Kneipp, K. ; Kneipp, H. Spectrochim. Acta A. 1993, 49, 167.
62 . Kneipp, K. Spectrochim. Acta A.1994, 50, 1023.
63. Wang, X.; Wen H, He. T. J; Zuo, J.; Xu, C. Y.; Liu, F. C. Spectrochim. Acta A 1997, 53, 2495.
64. Benevides, J. M.; Thomas, Jr., G.J. Nucleic Acids Res. 1983, 11, 5747-5761.
65. Thomas, G.A.; Peticolas, W.L. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 986-992.
66. Benevides, J. M.; Wang, A. H.-J.; van der Marel, G.A.; van Boom, J.H.; Thomas, Jr., G.J. Biochem. 1989, 28, 304-310.
67. Ruiz-Chica, J.; Medina, M.A.; Sanchez-Jimenez, F.; Ramirez, F.J. Biochim. et Biophys. Acta. 2003, 1628, 11-21.
68. Ruiz-Chica, J.; Medina, M.A.; Sanchez-Jimenez, F.; Ramirez, F.J. Biophys. J. 2001, 80, 443-454.
69. Chang, C.C.; Wu, J.Y.; Chien, C.W.; Wu, W.S.; Liu, H.; Kang, C.C.; Yu, L.J.; Chang, T.C. Anal. Chem. 2003; 75(22); 6177-6183
70. Deng, H.; Bloomfield, V. A.; Benevides, J.M.; Thomas, Jr., G.J. Biopolymers 1999, 50, 656-666.
71. Movileanu, L.; Benevides, J.M.; Thomas, Jr., G. J. J. Raman Spectroscopy.1999, 30, 637-649.
72. Chiu, T.K.; Kaczor-Grzeskowiak, M.; Dickerson, R.E. J. Mol. Biol. 1999, 292, 589-60873. Shui, X.; McFail-Isom, L.; Hu, G.G.; Williams, L.D. Biochem. 1998, 37, 8341-8355.
74. Wing, R.M.; Drew, H.R.; Takano, T.; Broka, C.; Tanaka, S.; Itakura, K.; Dickerson, R. E. Nature. 1980, 287, 755-758.
75. Deng, H.; Bloomfield, V.A.; Benevides, J.M.; Thomas, Jr., G.J. Nucleic Acids Research. 2000, 28, 3379-3385.
76. Yuki, M.; Grukhin, V.; Lee, C.-S.; Haworth, I. S. Arch. Biochem. Biophys. 1996, 325, 39-46
77. Korolev, N.; Lyubartsev, A.P.; Laaksonen, A.; Nordenskiöld, L. Biophys. J. 2002, 82, 2860-2875.
78. Korolev, N.; Lyubartsev, A.P.; Laaksonen, A.; Nordenskiöld, L. Biopolymers
2004, 73, 542-555
79. Shui, X.; McFail-Isom, L.; Hu, G.G.; Williams, L.D. Biochem. 1998, 37, 8341-8355.
80. Harworth, I.S.; Rodger, A.; Richards, W.G. Proc. R. Soc. Lons. B. 1991, 244, 107-116
81. Sequaris, J.M.; Koglin, E.; Valenta, P.; Nurnberg, H.W. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1981, 85, 512-513.
82. Lao,W.; Xu, C.; Ji, S.; You, J.; Ou, Q., Spectrochim. Acta Part A. 2000, 56, 2049-2060.
83. Cramer, C. J. ”Essentials of computational Chemistry - Theories and models”, Wiley, Chichester, 2002; p.305.