臺灣博碩士論文加值系統

摘要
角膜提供光源折射及穿透的重要功能，而角膜上皮細胞與淚液層形成一光滑的光學薄膜，提供角膜均勻的屈折係數及減少光線的散射。在某一些情形，例如燒燙傷、化學藥物灼傷、史蒂芬強生症候群（Steven-Johnson syndrome），使得上皮細胞異常，產生後遺症，甚至導致失明. 因此，重建上皮細胞，維持其功能正常是避免角膜及並惡化的關鍵。羊膜（Amniotic membrane，AM）移植是近年來用來作為許多眼睛疾病治療之用，於角膜研究發現，羊膜可作為受傷眼睛表面基底膜的取代物，促使上皮細胞生長。但是羊膜是取自生物體，可能有未知之感染風險，故希望能夠以其他人工或天然聚合薄膜來替代。幾丁聚醣（Chitosan）於生物醫學使用上相當的廣泛，它具有生物相容性、生物活性、降低免疫系統刺激作用、抗微生物作用等等的特性。本實驗目的是利用幾丁聚醣薄膜培養角膜上皮細胞，觀察細胞生長情形以及細胞內之生物活性。首先利用間接免疫法來觀察角膜上皮細胞標記（Marker）Keratin 3以及Connexin 43、Ki67蛋白質之表現，來了解角膜上皮細胞於幾丁聚醣薄膜上的生長狀況，再以RT-PCR了解基因表現的情形，以及利用Western Blot 來觀察Keratin 3及Connexin 43 於細胞中的表現量。結果顯示，以羊膜及幾丁聚醣薄膜培養之角膜上皮細胞，於間接免疫染色法（Indirect Immunochemistry）及免疫轉漬法（Western Blotting）實驗中發現，培養於羊膜及幾丁聚醣上之細胞，Keratin 3、Cx43、Ki67皆有表現，其Keratin 3表現量於基底膜上，並無明顯的差異；於RT-PCR中 Keratin 3、Connexin 43亦有表現。由實驗結果得知，角膜上皮細胞於幾丁聚醣薄膜上之生長情形與羊膜上相近，於未來可提供另一種移植材料的新選擇。

CONTENTS
摘要••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4
ABSTRACT•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5
INTRODUCTION•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7
REVIEW••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
I. Cornea•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
A. Epithelium••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
B. Endothelium•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10
II. Amniotic Membrane•••••••••••••••••••••••••••••••••••10
III. Chitosan••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
IV. Gene Expression of Corneal Epithelial Cells••••••••••••••••13
A. Keratin 3 and K12••••••••••••••••••••••••••••••••••13
B. Connexin 43•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13
MATERIALS AND METHODS•••••••••••••••••••••••••••••15
I. Materials••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
II. Methods••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
A. Preparation of Human Amniotic Membrane••••••••••••••16
B. Preparation of Chitosan Membrane•••••••••••••••••••••16
（a） Preparation of 2% chitosan solution •••••••••••••16
（b） Preparation of chitosan membrane•••••••••••••••17
C. Primary Culture of Corneal Epithelial Cells••••••••••••••17
D. RNA Isolation and RT-PCR Assay•••••••••••••••••••••18
E. Indirect Immunocytochemistry••••••••••••••••••••••••18
F. Western Blot Analysis••••••••••••••••••••••••••••••••19
RESULT AND DISCUSSION••••••••••••••••••••••••••••••20
I. Expression of phenotype in vitro•••••••••••••••••••••••••.20
A. Expression pattern of Multi-Keratin and Keratin3•••••••••20
B. Expression pattern of Connexin43•••••••••••••••••••••20
C. Expression pattern of Ki67•••••••••••••••••••••••••••21
II. Expression of mRNA in vitro••••••••••••••••••••••••••••21
III. Western Blot Analysis••••••••••••••••••••••••••••••••••21
A. Western Blot Analysis of Keratin 3 and Multi-Keratins•••••21
DISCUSSION•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
CONCLUSION••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
REFERENCE•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
FIGURES AND TABLE•••••••••••••••••••••••••••••••••••30

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