臺灣博碩士論文加值系統

本實驗利用茶葉改良場所保存的台灣地區茶樹品種為材料，將茶菁製備為綠茶，以HPLC定量茶葉中的10種兒茶素含量，並以兒茶素作為生化標誌進行茶種基因歧異度的變化的探討。同時也根據茶種兒茶素含量及分布的數據資料，進行主成份分析及依據UPGMA的群聚分析，以探討不同茶種兒茶素成分與品種、採收季節和適製性等農藝性狀關聯性之探討。並且以pITS2、trnL intron、trnL-trnF IGS之核苷酸序列作為分子標誌將茶葉改良場所保存的臺灣地區茶樹品種進行遺傳歧異度分析，並比對生化標誌之結果加以探討，以期建立臺灣茶樹品種之指紋資料庫的建立。
實驗結果顯示，臺灣育成品種的總兒茶素含量普遍高於其他品種，其中臺茶四號（TD04）總甲基化兒茶素含量又為所有茶種之冠，其含量占茶葉乾重3.3（g/100g d.w.），具有抗過敏保健功能之潛力。臺灣野生山茶品種的兒茶素普遍偏低，原生種雖然較一般栽培型茶樹具有較強的抗逆境能力，但通常帶有某些不良性狀，如產量及品質方面的缺陷。將兒茶素與農藝性狀做相關性分析，總兒茶素（TC）與Caffeine、EC、ECG、EGC、EGCG及四種甲基化兒茶素含量有極顯著正相關，Caffeine與EGCG、ECG含量也有極顯著正相關，而EGCG、ECG為酯型兒茶素，占為總兒茶素含量60～70％，因此推論茶種之兒茶素總含量較高時，咖啡因含量可能也會屬於偏高的茶種。咖啡因與EGCG的含量與於抗蟲害能力有很大關連性，抗蟎能力、抗卷葉蟲能力、抗捲葉蟲、抗薊馬皆有顯著或極顯著之正相關性，擁有高含量的咖啡因或EGCG對於抗病蟲害能力較優。
主成份分析結果，臺灣野生山茶品種落在第三與第四象限，臺灣野生山茶適合製作成紅茶茶葉，而適製紅茶品種之茶種也大部分落於第三與第四象限，而適製綠茶品種及適製部份發酵茶品種以原點為中心散佈於四個象限並且有重疊的現象，發現兒茶素的含量與分佈和茶種的適製性有關連性，可供作製茶之參考。使用MVSP軟體以UPGMA方法計算，對茶種做群聚分析，在Euclidean距離為8作為分群依據時，很明顯的將赤芽山茶（TD85）和水井（TD100）與其他茶種區隔開來成為獨立之群集，顯示出此兩株山茶品種的特異性。
將pITS2序列112條、trnL intron序列104條、trnL-trnF IGS序列98條分別以BioEdit進行多重序列排比（Multiple sequence alignments），發現pITS2序列具有較高之核苷酸序列多型性，序列相似度為 0.379~0.994，且變異位點高達149個；cpDNA序列保守性高，因此trnL intron與trnL-trnF IGS皆有相似度達100％的序列，trnL intron序列相似度為0.948~1.000， trnL-trnF IGS序列相似度0.979~1.000。可利用此三種DNA片段之分子標記技術以分析茶葉品種之差異之技術建立台灣地區茶種的DNA圖譜資料庫。
系統發育樹（Phylogenetic trees）之pITS2分析結果顯示，利用鄰位連接法（Neighbor Joining Method，簡稱NJ）、最小進化法（Minimum Evolution methods，簡稱ME）及最大簡約法（Mmaximum parsimony methods，簡稱MP）可將臺灣山茶分為兩個獨立之群集，證明臺灣野生茶之ITS2序列具有獨特性，但無法成功將臺灣地區茶種依親緣性或來源類型或茶葉適製性分群。本實驗結果除可建立茶樹的種質資源資料庫並可提供未來選植育種的參考。

In this study, different tea varieties preserved in Taitung Tea Research and Extension Station (TTES) were used as materials. Tea leaves were manufactured to green tea and 10 kinds of tea catechins were determined by HPLC, and to study the genes Diversity based on these chemical markers. Principal component analysis and UPGMA clustering analysis based on the contents of tea catechins have been used in the study of correlations between manufacturing suitabilities and agronomic traits. Molecular markers, including the nucleotide sequences of pITS2, trnL intron, trnL-trnF IGS were also used in determining the genetic diversity of teas preserved in Tea Research and Extension Station of tea in Taiwan.
Our results have shown that the breed tea varieties are generally have higher total catechin content. TTES No.4 has the highest methylation catechins of 3.3 tea (g/100g d.w.), with the greatest potential used in anti-allergy products, for all the tea species tested. Catechins contents in wild Camellia speciesis generally low. Even though these indigenous tea species are much more resist to the environment stress. Unfortunately, more or less negative agronomic traits will be carriered. Total catechins (TC) content is correlated to the contents of caffeine, EC, ECG, EGC, EGCG and four methylated catechin content. Caffeine’s content is correlated to the content of EGCG, ECG.
Principal component analysis (PCA) results have shown that Taiwan wild camellia Tea fell the third and fourth quadrant. Taiwan wild camellia Tea is best for making black tea, and most of the tea cultivars located in third and fourth quadrant are suitable for manufacturing black tea too. For those tea cultivars suitable for manufacturing green tea are scattering in all four quadrantswith overlapping some cultivars suitable for manufacturing Fermented tea. PCA results also indicated that the content and distribution of catechins are correlated with the tea varieties and the manufacturing suitablility and are valuable data for future tea breeding reference. The higher content of caffeine and EGCG are related to the capacities ofinsect resistance of tea, such as anti-mite, anti-leaf beetle, anti-thrips and leaf beetle resistance. Cluster analysis for tea varieties based on UPGMA method using MVSP software has separated two wild Camellia Tea (TD85 and TD100) can be species with other into an independent cluster, showing their genetic pecificity.
Single nucleotide polymorphisms were observed based on three multiple sequence alignments of pITS2 sequence of 112 tea varieties, 104 trnL intron sequences, and 98 trnL-trnF IGS sequencespITS2 has the highest nucleotide sequence polymorphism with sequence similarity between 0.379 ~ 0.994, and up to 149 variable sites. Two cpDNA sequences are relatively conserved in these two area, with sequence similarity of 0.948~1.000 for trnL intron and sequence similarity of 0.979 to 1.000 for trnL-trnF IGS. The sequence variation of pITS2 can be used in establishing the molecular fingerprinting database for Taiwan tea plants.
Phylogenetic trees constructed based on nucleotide sequence of pITS2 using Neighbor Joining Method, Minimum Evolution methods and Mmaximum parsimony methods can clustered wild teas in Taiwan into two independent clustersalong with other five groups. Our results in genetic diversity is important in future tea breeding selection program.

封面內頁
簽名頁
中文摘要iii
英文摘要vi
誌謝viii
目錄ix
圖目錄xii
表目錄xiv
1.前言1
2.文獻回顧3
2.1茶葉簡史3
2.1.1茶葉簡介3
2.1.2茶樹在生物學上的分類3
2.1.3臺灣茶樹簡史 5
2.2茶葉主要化學成分介紹8
2.2.1兒茶素8
2.2.2咖啡因9
2.2.3其他化學成分13
2.2.4以化學成分分析遺傳變異性13
2.3臺灣茶樹樹種之分子鑑定技術14
2.3.1臺灣茶樹種原介紹17
2.3.2分子標記之應用17
2.3.3細胞核內特定基因片段及葉綠體基因體的組成及其分子標誌之應用22
2.3.4DNA分子標記在臺灣茶樹品種資源研究24
2.4建立臺灣茶樹樹種DNA指紋資料庫29
3.材料與方法31
3.1材料與儀器31
3.1.1實驗材料31
3.1.2兒茶素含量分析之實驗藥品31
3.1.3兒茶素含量分析之儀器設備32
3.1.4萃取genomic DNA之實驗藥品33
3.1.5偵測DNA濃度之儀器設備34
3.2研究方法39
3.2.1兒茶素測定39
3.2.2茶樹種原兒茶素及葉部性狀之分析39
3.2.3萃取Genomic DNA40
3.2.4引子設計41
3.2.5聚合酶鏈鎖反應43
3.2.5電泳分析46
3.2.6定序46
3.2.7臺灣茶種DNA資料庫之建立與序列分析46
4.結果與討論47
4.1以生化標誌將臺灣茶種建立種原資料庫 47
4.1.1茶葉葉片中兒茶素的HPLC分析與定量47
4.1.2臺灣茶樹種原兒茶素差異及相關性分析60
4.1.3臺灣茶樹種原兒茶素與農藝性狀之相關性分析62
4.1.4茶樹品種間兒茶素的主成份分析65
4.1.5依據生化標誌將臺灣茶樹種原進行群集分析71
4.2 以分子標誌將臺灣茶種建立種原資料庫 75
4.2.1pITS2序列分析75
4.2.2依據pITS2序列進行茶樹種原之群集分析85
4.2.3cpDNA序列分析88
4.2.4依據cpDNA序列進行茶樹種原之群集分析102
5.結論108
參考文獻110
圖目錄
圖2.1兒茶素結構圖10
圖2.2甲基化兒茶素結構圖11
圖2.3兒茶素前驅物與咖啡因結構圖12
圖3.1pITS2序列結構示意圖42
圖3.2trnL-trnF IGS與trnL intron序列結構示意圖43
圖4.1(-)-Gallocatechin（GC）和caffeine之檢量線48
圖4.2(-)-Epigallocatechin gallate（EGCG）和(-)-Epigallocatechin（EGC）之檢量線49
圖4.3(-)-Catechin（C）和(-)-Epicatechin（EC）之檢量線50
圖4.4(-)-Epicatechin gallate（ECG）之檢量線51
圖4.5兒茶素、咖啡因和甲基化兒茶素HPLC圖譜52
圖4.6臺東茶葉改良場107種茶樹樹種編號對照之主成分散佈圖68
圖4.7臺東茶葉改良場107種茶樹種原類型主成分散佈圖69
圖4.8臺東茶葉改良場107種茶樹種親緣性原類型主成分散佈圖70
圖4.9以化學成分進行將臺灣茶樹樹種107種作群集分析所得UPGMA圖73
圖4.10裁切pITS2序列示意圖，以臺茶12號為例76
圖4.11臺灣茶樹種原pITS2多重序列比對圖77
圖4.12臺灣茶樹種原pITS2分子標誌群集分析圖86
圖4.13臺灣茶樹種原trnL intron多重序列比對圖90
圖4.14臺灣茶樹種原trnL-trnF IGS多重序列比對圖97
圖4.15臺灣茶樹種原trnL intron分子標誌群集分析圖104
圖4.16臺灣茶樹種原trnL-trnF IGS分子標誌群集分析圖106
表目錄
表2.1茶葉的分類及製法4
表2.2臺灣茶業改良場培育的茶種及其形態特徵表7
表3.1臺灣育成茶樹品種資料表35
表3.2臺東茶業良場保存茶樹之品種資料表36
表3.3pITS2、trnL-trnF IGS與trnL intron PCR反應溶液配方44
表3.4pITS2 PCR溫度循環參數45
表3.5trnL-trnF IGS與trnL intron PCR溫度循環參數45
表4.1臺東茶業改良場107種茶樹品種化學成分分析表53
表4.2不同茶樹品種兒茶素與咖啡因含量範圍59
表4.3臺東茶葉改良場107種茶葉生化成分之相關性61
表4.4兒茶素與農藝性狀之相關性64
表4.5臺灣主要茶種10項化學成分之主成分分析特徵向量67
表4.6利用生化標誌得到107個茶樹種原群集聚分群表74
表4.7臺灣茶樹種原pITS2序列相似度79
表4.8臺灣茶樹種原pITS2序列變異位點與核苷酸比例表80
表4.9臺灣茶樹種原trnL intron序列相似度89
表4.10臺灣茶樹種原trnL intron序列變異位點與核苷酸比例表95
表4.11臺灣茶樹種原trnL-trnF IGS序列相似度96
表4.12臺灣茶樹種原trnL-trnF IGS序列變異位點與核苷酸比例表101

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