臺灣博碩士論文加值系統

由於含微量元素之生物分子在生物體內扮演著許多重要的生化功能，相關的研究工作近年來業已成為分析化學領域中的一個重要的研究主題。但由於生物體內含有微量元素的生物分子通常係以極低濃度存在，且生物樣品的基質十分複雜，致使在分析方法之發展上仍有諸多困難尚待克服。
本研究研究的目的旨在建立一套二維形體篩分/逆相層析技術，並配合感應耦合電漿質譜法及電灑質譜法，進行口服液樣品及血清樣品中含金屬分子(metal-binding biomolecule)之鑑定工作。在評估所欲建立之分析系統對含有特定微量元素之生物分子鑑定能力的過程中，有鑑於文獻中有關金屬硫蛋白分子的研究已相當透徹，因此於方法建立之初，本研究係選擇金屬硫蛋白(metallothionein, MT)來進行方法可行性的研究。在確立所欲建立分析方法的可行性之後，本研究亦嘗試利用所建立之分析程序，試圖探求其在鑑定兔子血清中含有Cu，Zn，Co等元素之生物分子時可能遭遇之困難及適用性。
根據目前所獲致之實驗結果可知，本研究所開發之2D-SEC/RPLC層析系統，已可順利地鑑定出口服液樣品及兔子血清樣品中的金屬硫蛋白分子及維生素B12分子。但受到RPLC-ESI-MS偵測的靈敏度及RPLC分離效果的限制，目前仍無法確定地鑑定出血清樣品中含銅及鋅的生物分子。為克服上述分析技術上的限制，未來應可藉由提高濃縮倍數，增進RPLC分離純化效果及改用更為靈敏以及具有更寬mass range的分子鑑定技術來達成鑑定生物體內金屬蛋白的目的。

第一章 序論 1
1.1生物體內微量元素的重要性 1
1.2金屬質組學(Metallomics)的重要性 2
1.2.1生物體內與金屬鍵結生物分子之分析的難題 4
1.2.2生物體中金屬生物分子分析技術的需求 7
1.3金屬、類金屬以及金屬生物分子之生理意義 9
1.3.1銅（copper，Cu） 9
1.3.2鋅（zinc，Zn） 10
1.3.3 鈷（cobalt，Co） 11
1.3.4 鎘（cadmium，Cd） 11
1.3.5 金屬硫蛋白之性質 12
1.3.6 維生素B12之性質 15
1.4 研究目的 16
1.5參考文獻 17
第二章 分析儀器原理 27
2.1形體篩分層析法 (size-exclusion chromatography，SEC) 28
2.1.1 SEC 分離原理及影響其分離能力之因素 29
2.1.2 SEC的填充材料 33
2.1.3 分子量校正法 34
2.1.4 非形體篩分效應 (non-size exclusion effect) 35
2.1.5 SEC的優缺點 35
2.2 高效能逆相層析管柱原理(reverse phase liquid chromatography，RPLC) 36
2.2.1 逆相層析管柱的填充材料 37
2.2.2 胺基酸的基本性質 38
2.2.3 RPLC的優缺點 40
2.3 感應耦合電漿質譜儀分析法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS) 40
2.3.1 感應耦合電漿離子源(the ICP as an ion source) 41
2.3.2 離子萃取(ion extraction) 43
2.3.3 離子聚焦(ion focusing) 44
2.3.4 四極柱式質量分析器(quadrupole mass analyzer) 44
2.3.5 離子偵測(ion detection) 45
2.3.6 感應耦合電漿質譜儀之分析特性與其限制 46
2.4 電灑串聯質譜儀分析法(electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS) 49
2.4.1電灑過程之參數 52
2.4.2 串聯質譜之偵測模式 55
2.4.3 電灑質譜之解析原則 57
2.4.4 ESI-MS 之優缺點 58
2.4.5 ESI-MS之應用分析 59
2.5 參考文獻 62
第三章 實驗部份 76
3.1 儀器裝置 76
3.2 藥品及用水 77
3.3 容器清洗 78
3.4 層析流洗液之配製 78
3.5 分離管柱之使用及保存 79
3.6 動物基本資料及來源 80
3.7 連線系統之建立 81
3.8 實驗流程 81
A. 樣品製備與保存 81
B. 層析分離條件之探討 81
C. 實驗流程 82
第四章 結果與討論 85
4.1分子鑑定技術可行性之研究 86
4.1.1 SEC參數之最佳化 87
a. 動相溶液之選擇 87
b. 動相pH值之選擇 91
c. UV偵測器波長之選擇 91
d. 樣品注入量之選擇 92
e. 分子量檢量線之建立 93
4.1.2 口服液樣品中MT分子之鑑定 93
4.1.3 方法效能評析 97
4.2 利用二維SEC/RPLC分離技術搭配UV/Vis，ICP-MS及ESI-MS進行兔子血清樣品中含有銅、鋅生物分子暨維生素B12分子之鑑定研究 99
4.2.1維生素B12給藥方法、濃度變化驅勢及標準品質譜圖 99
4.2.2 SEC分離條件之探討 100
a. SEC管柱之選擇 101
b. 動相之選擇 102
c. 流速之選擇 102
d. 樣品注入量之選擇 103
4.2.3 RPLC分離條件之探討 104
a. RPLC管柱之選擇 104
b. 動相組成之選擇 104
4.2.3 兔子血清中含銅、鋅生物分子暨維生素B12分子之鑑定 105
4.3 參考文獻 111
第五章 結論 147

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