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目錄
目錄………………………………………………………………….….Ⅰ
中文摘要………………………………………………………….……..1
英文摘要………………………………………………………….……..2
緒論………………………………………………………………….…..3
壹、車前科植物之文獻考察……………………….……..………3
貳、本論文研究目標……………………………..………………10
（一）抗癌、抗病毒活性之研究……………….……………...10
（二）免疫調節活性的研究………………………………….18
（三）探討有效成分在抗病毒的作用機轉………………….20
材料和方法…………………………………………………………….25
壹、車前草生藥之萃取…………………………………………..25
貳、試藥…………………………………………………………..25
參、細胞的培養…………………………………………………..26
肆、抗癌活性的測定……………………………………………..27
伍、抗病毒活性的測定…………………………………………..29
陸、免疫調節活性的測定………………………………………..32
柒、統計分析……………………………………………………..34
結果…………………………………………………………………….35
壹、抗癌活性………………………………………………….…35
貳、抗病毒活性……………………………………………….…39
參、免疫調節活性…………………………………………….…41
討論……………………………………………………………………45
壹、抗癌活性…….………………………………………………45
貳、抗病毒活性………………………………………………….48
參、免疫調節活性……………………………………………….51
肆、總結………………………………………………………….55
圖表…………………………………………………………...…….….58
參考文獻……………………………………………………………….87
學會發表……………………………………………………………….98
緒論
車前草（Plantago asiatica L.）為車前科（Plantaginaceae）車前屬（Plantago）的植物，與同是車前屬，外觀近乎一模一樣的大車前草（Plantago major L.），均分佈於溫暖及亞熱帶歐亞地區，台灣則生長於溫暖潮濕多雨處，最常於道路旁或牛馬車跡旁見其蹤跡，因而得名。
車前草又稱五根草、台灣車前、鼎坎草，藥用部分為種子或全草。全草可利尿、清熱、明目、袪痰，其種子具有利尿、袪痰、明目作用外，另具有鎮咳、止瀉之功效，對小便不通、血尿、白帶、熱痢、黃疸、感冒及高血壓等亦具療效（李勉民, 民83；高木村, 民85）。
大車前草又稱錢貫草、蒲杓草，藥用部分為全草，可利尿及鎮咳，還可以止瀉、明目，治尿路感染、結石、腎炎水腫、腳氣水腫、高血壓、急性眼結膜炎、肝炎，用鮮草搗爛外敷患處可治創傷或腫瘤，而種子研末調油可治皮膚癌症（中國生草藥研究發展中心編撰, 民65-66； 英國蓋爾圖書公司著, 民84；莊兆祥等編, 1980）。
壹、車前科植物之文獻考察（表A-C）
車前草之名自古即有。古時候馬車或人力車，在泥土或石上行進時，車前不停地出現，因此稱之為車前草。分布於全台灣省平地至山區，從鄉村到城市，從荒地到耕地，到處皆有其蹤跡。
屬於一年生或多年生草本植物；單葉，根生，基部成鞘狀，葉脈常近平行；花少，兩性，輻射對稱，穗狀花絮；萼片4，宿存；花冠膜質，合瓣，3∼4裂片；雄蕊4；子房上位，1∼4室，中軸胎座；果小，蓋果或蒴果。
PLANTAINACEAE（台灣植物誌編輯委員會編撰, 民67）
1. 大車前草（中國生草藥研究發展中心編撰, 民65-66；英國蓋爾圖書公司著, 民84；莊兆祥等編, 1980）
1.1 學名：Plantago major Linn.
1.2 科名：車前科Plantaginaceae
1.3 別稱：錢貫草、蒲杓草
1.4 型態：多年矮小草本，地下根狀莖短而粗厚。蓮座葉叢（rosette），葉子均成卵形或橢圓形，長5∼30公分，寬3.5∼10公分，葉頂端鈍形，具有五至七條主葉脈，葉基向下延伸到葉柄，葉柄寬而擴大，波狀葉緣，葉叢生於根莖上，花絮呈穗狀，長約6∼12公分，多數密集小型的白花，夏秋之間開放，雄蕊四枚；棕色蓋果呈寬圓錐形，內藏成熟黑色種子的數目8∼16顆，其長約1.2公厘的大小（圖A, B）。
1.5 分布：歐亞大陸，溫帶和亞熱帶地區，台灣在大部分低濕地區，生長於路前、村前屋後、荒地和潮濕草地上。
1.6 化學成分：含Aucubin、Baicalin、Baicalein、Caffeic acid、Chlorogenic acid、ferulic acid、Luteolin、Oleanolic acid、p-Coumaric acid、Ursolic acid、Vanillic acid等（Duke, J.A., 1992；Samuelsen, A.B., 2000）。
1.7 藥理活性：利尿、清熱、明目、去痰，其種子也具有利尿、去痰、明目外，還能鎮咳、止瀉等。
2. 車前草（李勉民, 民83；高木村, 民85）
2.1 學名：Plantago asiatica Linn.
2.2 科名：車前科Plantaginaceae
2.3 別稱：五根草、台灣車前、鼎坎草
2.4型態：多年矮小草本，地下根狀莖短而粗厚。蓮座葉叢（rosette），葉子均成卵形或橢圓形，長6∼15公分，寬3∼8公分，葉頂端鈍形，具有五至七條主葉脈，葉基向下延伸到葉柄，葉緣少鋸齒狀，葉叢生於根莖上，花絮呈穗狀，長約2∼10公分，多數密集小型的白花，夏秋之間開放，雄蕊四枚；棕色蓋果呈寬圓錐形，內藏成熟黑色種子的數目4∼6顆，其長約1.5∼1.8公厘的大小（圖A, B）。
2.5 分布：歐亞大陸，溫帶和亞熱帶地區，台灣在大部分低濕地區，生長於路前、村前屋後、荒地和潮濕草地上。
2.6 化學成分：含Aucubin、Ursolic acid、Linalool等（Duke, J.K., 1992）。
2.7 藥理活性：利尿、鎮咳、止瀉、明目，治尿路感染、結石、腎炎水腫、腳氣水腫、高血壓、急性眼結膜炎、肝炎，外用鮮草搗爛敷患處可治創傷或腫瘤，種子若研末調油可治皮膚癌症。
3. 6類12種相關成分存在於：
本論文所用車前屬6類12種相關成分，也存在於多種天然食用或藥用植物（Duke, J.A., 1992）：
3.1 Flavonoids：baicalin、baicalein也存在於黃芩、半枝連等，luteolin也存在於金銀花、野菊花、薄荷、苦參等。
3.2 Triterpenoids：ursolic acid、oleanolic acid也存在於白花蛇舌草、日日春、夏枯草等。
3.3 Phenolic compounds：caffeic acid也存在於胡蘿蔔、伏牛花、硬花甘藍、香瓜等；chlorogenic acid也存在於牛蒡、金盞菊、辣椒等；p-coumaric acid也存在於大蒜類等；ferulic acid也存在於當歸、落花生、雞冠花、黃連等。
3.4 Monoterpenoids：linalool也存在於大蒜類、當歸類等。
3.5 Benzoic compound：vanillic acid也存在於洋蔥、當歸等。
3.6 Iridoid glycoside：aucubin也存在於木通等。
從文獻報告得知，車前草及大車前草含有許多活性成分（Duke, J.A., 1992；Samuelsen, A.B., 2000），它提供我們深入研究的方向。1992年，Lithander指出大車前草的水抽物，可以預防老鼠的乳腺癌（Lithander, A., 1992）。多醣類（polysarcharides）目前的研究成果在於刺激B cell的增生及抗胃炎作用（Sakurai, M.H., et al., 1999）；1994年，Kimata等人發現三類（triterpenoids）的齊墩果酸（oleanolic acid）、熊果酸（ursolic acid），可抑制mast cell釋放histamine和cytokine，並具抗氧化的作用（Kimata, M., et al.,1999）。1995年，Liu所作的動物實驗證實三類具有抗發炎、抗高血脂的效果（Liu, J., 1995）。同年Inada等發現它們具有抑制由TPA誘發細胞內EBV表現病毒早期抗原（Early Antigen；EA）的特性（Inada, A., et al., 1995）；1995年，Constantinou等在報告中指出，植物的Flavonoids可抑制酵素的活性包括Protein kinase C、DNA topoisomerase II（topo II）（Constantinou, A., et al., 1995）。1996年，Lin等發現黃芩元（baicalein）可以保護老鼠由CCl4所誘發的肝臟損傷（Lin, C.C. and Shieh, D.E., 1996）。1998年，Nishioka等發現baicalein和黃芩（baicalin）可以藉由抑制α-glucosidase阻止腸道吸收醣類（carbohydrate），來抑制用餐後的高血糖（Nishioka, T., et al., 1998）。1989年，Labadie等，證明苯甲酸化合物（benzoic compound）類的香莢蘭酸（Vanillic acid）可以表現有效的抑制多形核中性球細胞（PMN）的活化（Labadie, R.P., et al., 1989）。1994時，Ortiz de Urbina等，認為屬於等環臭蟻醛類（iridoid）的桃葉珊瑚（aucubin）具抗發炎、解除痙攣的活性（Ortiz de Urbina A.V., et al. 1994）。再者，1983年，Lesca 證實酚類化合物（Phenolic compounds）的阿魏酸（ferulic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）能抑制老鼠的肺癌（Lesca, P., 1983）。1995年時，Carson等發現單類（Monoterpenoid）的芳樟醇（Linalool）有抑菌的作用（Carson, C.F. and Riley, T.V., 1995）。
根據上述的研究文獻顯示，天然植物所具有的藥理活性是屬於多方面的。而目前藥物治療上，不論是癌症或病毒感染方面，雖然有些臨床用藥，但是藥物毒性、副作用及抗藥性的增加，皆顯示開發或找尋有效的抑制藥物已刻不容緩（Cassady, K.A. and Whitly, R.J.,1997；Shu, Y.Z., 1998）；所以利用天然藥用植物所具有的多樣性藥理活性，不啻是一種藥物開發的新契機！
因此，本論文擬以車前科車前屬植物及相關成分，進行三方面生物活性的研究，而主題目標有三個。
貳、本論文研究的目標
（一）抗癌、抗病毒活性之研究：
一、抗癌的回顧
科技文明的進步、生活品質的提升，使人類不論在物質或精神上都有很好的的享受，但所導致的危機，像空氣、水源的污染，及食物的過於加工，導致我們不知不覺中與癌愈走愈近。
根據衛生署從民國72年起至89年出版的「中華民國公共衛生概況」，這十八年來台灣十大死因的統計，均以惡性腫瘤為首，而民國88年的十大死因的頭號殺手惡性腫瘤的排名依序為肺癌、肝癌、結腸直腸癌、胃癌、女性乳癌、子宮頸癌、口腔癌、攝護腺癌、非何杰金淋巴癌、胰臟癌等（行政院衛生署編, 民72∼89）。
由報告分析惡性腫瘤的發生率，腫瘤的發生幾乎每十萬人口就有170人可能罹患癌症，和前年比較約每十萬人口增加40.95人，平均每十五分鐘就有一人罹患癌症（行政院衛生署編, 民89）。再與世界各國做比較發現，惡性腫瘤同樣位居日本、英國、美國、德國、及新加坡的首位。美國平均每年用於治療惡性腫瘤上耗費超過1000億美元（Pezzuto, J.M., 1997）。
長久以來，人們就利用地球上的植物來治療疾病，因此，也有相當多的報告著重在天然藥物的研究，從1961年時美國國家癌症中心（NCI）即利用天然植物進行篩選有效的抗癌藥物，從此投予相當多的人力與財力在天然藥物的開發（Statz, Z., and Coon, F.B., 1976；Carter, S.K., and Livingston, R.B., 1976）。研究報告顯示，世界上總數約45億人口中79％有某種程度的依賴傳統的藥物（Pezzuto, J.M., 1997），如今使用在臨床抗感染性疾病及抗腫瘤上面的藥品，有60％由天然植物所分離出來，（Cragg, G.M., et al., 1997；Shu, Y.Z., 1998）。
如從喜樹（Camptotheca acuminata）分離的Camptothecin有抑制topoisomerase I的作用，能抑制生長緩慢腫瘤的DNA合成作用（Lown, J.W., and Chen, H.H., 1980；Pommier Y., 1993；Wall, M.E., et al., 1996）；另外由曼陀羅（Mandrake）植物所純化出來（Hartwell, J.L.and Schrecker, A.W., 1958；Imbert, T.F., 1998）能抑制topoisomerase II的etoposide（VP-16）及teniposide（VM-26），使用於治療生長快速的腫瘤（Stähelin, H.and von Warturg, A., 1989；Constantinous, A., et al., 1995）；從紫杉（Taxus brerifolia）萃取出來的Taxol，可以誘發p53-independent G2-M的停止，使細胞進行apoptosis（Trielli, M.O., et al., 1996）。再者，日日春（Catharanthus roseus）分離的Vinblastine與皮素（quercetin），具有抗癌作用（Kato, R., et al., 1983；Deschner, E.E., et al., 1991）。
二、抗病毒的回顧
1. 疹病毒
1.1 流行病學
在眾多因為性接觸所造成的病毒傳染性疾病中，以單純疹病毒（Herpes Simple Virus；HSV）感染最常見（Corey, L., 1994），疹病毒感染遍及全世界，其最明顯的特性也是最困擾曾受感染過的患者，即是潛伏性感染（Tempesta, M., et al., 1999）。早期因無法分辨HSV-1與HSV-2抗體，故根據流行病學的調查，只能顯示疹病毒在成人的感染率約50∼100%。後來進一步的研究調查，不但確定上述的觀察，更證實有10∼70% 疹病毒第二型（HSV-2）是經由性行為及社交活動所傳染（Nahmias, A.J., et al., 1970）。在美國有超過6千萬的人感染過疹病毒（Corey, L., 1994）。
1.2 病毒特性
直徑約為120∼200 nm左右，含有線性雙股DNA的病毒，僅小於
痘病毒，歸類於DNA病毒，並可因感染人類性質分三個亞科，如易在神經內潛伏的α型病毒，有最常見的疹病毒第一型（HSV-1）及疹病毒第二型（HSV-2），另外還有潛伏在腺體細胞內的β型病毒及潛伏在淋巴球的γ型病毒。具有套膜的DNA病毒，對乙醚或1%石碳酸敏感，並且對熱不安定，在-70℃下可保存很久，分子量約為85×106∼106×106，含有將近80個蛋白質，卻只有一半是病毒複製所需。病毒複製的方式屬於典型的DNA複製，如下圖：
（Davis, B.D., et al., 1990）
1.3 致病機轉
疹病毒感染通常經由接觸而傳染，可經水、唾液及陰道分泌物傳染，唾液是常見的感染來源。主要侵犯皮膚與黏膜。HSV-1和HSV-2感染的致病機轉非常類似，均為感染黏膜表皮，然後再分布到神經元，建立潛伏性感染黏膜表皮。一般來說，病毒經由口腔接觸、共用眼鏡、牙刷或唾液污染的物品傳染，和皮膚接觸後病毒也會從皮膚傷口進入。型1病毒HSV-1常引起唇疹（herpes labialis），主要引起腰部以上部位的感染，造成疹性角膜炎或唇疹產生，較少引起生殖器方面的疾病；而型2病毒HSV-2是引起腰部以下的感染，產生濕疹型疹、生殖器疹等疾病（Murray, P.R., et al., 1998）。
2. 腺病毒
2.1 流行概況
腺病毒（Adenovirus；ADV）感染造成許多的臨床疾病，在免疫抑制患者更有明顯的罹患率和死亡率，因為感染腺病毒會造成像肺炎和出血性膀胱炎等併發症（Hierholzer, J.C., 1992）；腺病毒雖然在自然界中並無明顯的傳染窩，但其病毒體在乾燥、界面活性劑、酸、蛋白酶及膽汁、甚至溫和的氯處理下都能保持穩定特性，因此在人和人密切接觸的場所，像托兒所、學校、醫院、公共場所、游泳池等均為病毒散播的有利空間（Straube, R.C., et al., 1983）。此外，日本在1989∼1991年期間，從結膜炎患者的血清中分離出第3型腺病毒，而4、7、8、19、37等型也都是造成結膜炎的主因（Ford, E., et al., 1987）。腺病毒引起的結膜炎在1977年造成喬治亞洲大流行，在1986年時也曾爆發過（Colon, L.E., 1991；Jernigan, J.A., et al., 1993）
2.2 病毒特性
腺病毒含有雙股線形DNA，直徑為70∼90nm、二十面體，分子量約為20 ×106∼30 ×106，不具外套膜，因此對乙醚及氯仿有抗性。病毒DNA在宿主細胞核內複製，其早期轉錄的基因產物能促進細胞增殖及病毒DNA複製。
腺病毒首先在1953年，從施行扁桃腺切除術及腺體切除術患者所切除的咽扁桃腺中分離出來，迄今約有100種血清型被發現，且至少有51種可感染人類。在腺病毒的51種型別中，以第3、5、7型等造成人類的疾病為最嚴重（De Jong, J.C., et al., 1999；Allard, A, et al., 2000）。
2.3 致病機轉
病毒主要感染呼吸道、腸胃道、結膜或角膜的黏膜表皮細胞，直接對細胞造成傷害。病毒的傳播機轉可藉由空氣、親密接觸或者糞-口途徑的散播導致咽喉感染，氯消毒不完全的游泳池水則傳播至眼睛造成結膜炎。再者腺病毒感染，會造成每年冬天呼吸道、夏天眼睛疾病的大流行、急診就醫的急性病毒腸胃炎，此外也常引發軍隊中新兵嚴重的呼吸道感染流行，甚而在免疫缺陷的病人、接受移植者，引發更嚴重的併發症，像腺病毒第7型引起的肺炎（Dudding, B.A., et al., 1972），腺病毒第8型院內感染也爆發過新生兒肺炎，腺病毒第11型引起出血性膀胱炎、肺炎，並且為孩童急性出血性膀胱炎主因等（Straube, R.C., et al., 1983；Piedra, D.A., et al., 1992）。
三、抗癌和抗病毒活性的研究
目前被用來當做抗癌藥物成分可歸類為1. Alkylating agents, 2. Tubulin binding agents, 3. DNA binding agents and topoisomerase inhibitors, 4.Anti-endocrine agents, 5. Protein modification inhibitors（Teicher, B.A., 1997 ; Shu, Y.Z., 1998 ; Gibbs, B.S., et al., 1999）。另外最常使用於治療生長緩慢之固形腫瘤，例如結腸癌、乳癌、胰臟癌、胃癌等，和局部使用於表淺之基底細胞癌治療的5-Fluorouracil為合成的pyrimidine類似物，能與去氧尿嘧啶單磷酸（dUMP）競爭thymidylate合成酶，造成DNA合成減少，使細胞生長失去平衡並導致死亡（Bosch, L. et al., 1958）。數種nucleoside analogues用於治療病毒感染（Wood, A.J.J., 1999）。而植物及其成分也有抗病毒活性，例如珠子草（Phyllanthus niruri），不僅在體外可抗B型肝炎病毒，而且也用於臨床治療（Venkateawaran, P.S., et al., 1987）；再者可抑制HSV的植物成分有生物鹼（alkaloid）（Rahman, A.U., et al., 1992; Montanha, J.A., et al., 1995; Boustie, J., et al., 1998）、類（terpenes）、多醣類（polysaccharides）（Bourne, K.Z., et al., 1999）、固醇Steroidal glycoside（Ikeda, T., et al., 2000）等。
當今仍缺乏臨床抗腺病毒藥物，而目前治療疹病毒的Acyclovir較過去使用的Vidarabine能更有效的提高病患使用後的存活率，並且更能有效的抑制疹病毒感染急性期的病毒複製。Acyclovir首先被HSV之thymidine kinase單磷酸化，再被宿主細胞酵素轉成三磷酸，嵌在病毒之DNA複製鏈上，使DNA複製中斷（Murray P. R., et al., 1998）。但隨著病毒感染普遍的增加，而抗藥性病毒也不斷的增加，因此變成一個嚴重的問題（Cassady, K.A. and Whitly, R.J., 1997）。
目前在臨床癌症治療上並無很有效而且副作用小的用藥，腺病毒感染也缺少有效用藥。會造成潛伏性感染並伺機發病的疹病毒，雖有治療藥，但是卻出現抗藥性問題。有鑒於過去車前科植物中車前草、大車前草在民間被用來治療呼吸道、消化道、急性眼結膜炎、泌尿道感染等，均有不錯的效果，也有報告指出大車前草可以預防老鼠的乳腺癌（Lithander, A., 1992），保護肝臟損傷（Aktay, G., et al., 2000）；1986年，Mori等人發現給予老鼠口服chlorogenic acid，可以抑制老鼠因methylazoxymethanol acetate的作用而長腫瘤（Mori, H., et al., 1986）；由黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）所分離的baicalin、baicalein、wogonin有抗癌效果（Ikemoto, S., et al., 2000）。由於有效成分及安全性未經驗證，因此本研究著手於車前屬植物的粗抽物及其相關成分抗癌、抗病毒的有效性及活性成分測試，進行體外抗癌（懸浮性血癌細胞株、附著性固形癌細胞株）、抗病毒（Herpesvirus-1、Herpesvirus-2、Adenovirus-3、Adenovirus-8、Adenovirus-11）篩選，期望找到有效抑癌、抗病毒的活性的成分。
（二）免疫調節活性的研究：
癌症形成的原因和遺傳、病毒、化學物質、輻射線等有很大的關係，但免疫機能的喪失和得到癌症也有密切的關係，得癌症或病毒感染後要痊癒也少不了免疫系統的參與。因此著手於調整免疫機能，增強免疫能力作用，使身體有正常的防衛機制，來減少癌症的發生及病毒的感染，也是另一個預防保健和治療的重點。
從免疫學角度的觀點而言，免疫的監控在於防止傳染病及腫瘤的發生等。在病毒感染之後及腫瘤形成之前免疫系統就加以攻擊，因此免疫系統在抑制傳染疾病的發生、腫瘤的形成與排除上扮演著重要的角色。
消滅入侵的病毒時，早期靠非特異性免疫，防禦的因子包括干擾素（Interferon，IFN）及自然殺手細胞（Natural killer [NK] cell）。干擾素會抑制病毒的複製，即細胞被病毒感染後，會誘發產生IFN-α、IFN-β，促使附近細胞抗病毒的機轉活化來抵抗病毒的擴散，當病毒感染進入後期，特異性的免疫作用則被活化，IFN-γ可以刺激增加MHC-I、MHC-II分子的表現來提高特異性免疫反應的能力，並且可以活化NK細胞的功用（Mogensen, S.C., 1979；Johnston, R.J., 1998）。
在消滅腫瘤的免疫反應時，可藉由淋巴球CTL或NK cells直接毒殺腫瘤的作用，或者Th cell的活化後釋出細胞激素（cytokines），促進CTL、NK cells、Macrophages等成熟及細胞毒殺活性，細胞激素也能刺激促進LAK cell的毒殺或促進抗體依賴性的細胞媒介的毒殺作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC） 等（Roitt, J., et al., 1998；Goldsby, R.A., et al., 1999）。
免疫活化可以促進正常淋巴球的增生，並且刺激細胞激素的分泌，藉由細胞激素的分泌與各式各樣的免疫細胞溝通、調控，例如活化的macrophages可以產生細胞毒殺因子，像nitric oxide、TNF-α及刺激IFN-γ的分泌，來保護宿主對抗疾病與腫瘤的發展，清除因為不正常細胞或是傳染病原造成的傷害（Meltzer, M.S., et al., 1982）。
數篇研究報告顯示天然植物的成分具有調控免疫的功能：如chlorogenic acid可以有效的增進人類單核細胞的增生，及IFN-γ的產生（Lin, L.C., et al., 1999）。Ferulic acid抑制感染流行性感冒病毒的老鼠分泌IL-1和IL-8（Hirabayashi, T., et al., 1995）。Oleanolic acid及Ursolic acid會刺激老鼠脾臟細胞增生（Hsu, H.Y., et al., 1997）。Baicalein抑制老鼠細胞性和体液性的免疫（Kim, C.J. and Cho, S.K., 1991）。
接下來為了瞭解在車前屬植物生藥萃取物及相關成分是否具有促進lymphocyte增生的效應，因此本研究進行lymphocyte transformation的實驗，同時探討其中是否也有細胞激素的改變，如IFN-γ。
（三）探討有效成分在抗病毒的作用機轉
研究活性成分的作用機轉：抗病毒方面，探討活性的成分，抑制病毒的機轉是在抑制病毒繁殖的附著，穿入，或複製。
圖A 大車前草與車前草全草
圖B 大車前草與車前草種子
表A車前屬植物車前草與大車前草之比較
Plantago asiatica Linn.車前草Plantago major Linn.大車前草
生長特性多年生草本，葉自根際長出多年生草本，葉自根際長出
葉蓮座葉叢 (rosette)葉薄，橢圓形至寬橢圓形，很少長方形，長6-15 cm，寬3-8 cm，葉頂端鈍形葉緣少鋸齒狀，無毛葉柄長4 cm，底部擴大蓮座葉叢 (rosette)葉厚，橢圓形至長橢圓形，有時心形橢圓，長5-30 cm，寬3.5-10 cm，葉頂端鈍形葉緣波浪鋸齒狀，3-7個葉脈，無毛或細微軟毛葉柄寬而擴大
花穗狀花序，長2-10 cm，多或少密集的花，通常無毛苞葉綠色，橢圓形，比花萼短，大約長1.5 mm，寬1 mm，無花梗萼片長橢圓形，長2 mm，寬1.5 mm，頂端圓形花冠長三角形，大約長1 mm花莖堅實豎立，長15-30 cm穗狀花序，長1-5 cm，密集的花苞葉綠色，橢圓形，通常比花萼短萼片圓橢圓形，長2-3 mm花冠三角形，大約長1.3 mm
果實蒴果長橢圓形，長3.5 mm，寬2 mm中軸胎座蒴果棕色，寬圓錐形，頂端圓形中軸胎座
種子4-6個，很少8-10個，棕黑色，橢圓形平凸狀，大約長1.5-1.8 mm6-16個，黑色，尖形，大約長1.5 mm
分佈廣佈於亞洲，全台灣原野、路旁、田園歐亞大陸，溫帶和亞熱帶地區，台灣田野和低濕地區
參考文獻：中國生草藥研究發展中心, 民65-66; 鄭元春, 民78; 高木村, 民78; 李勉民, 民83; 英國蓋爾圖書公司著, 民84; 鄭元春等, 民85
表B大車前草（P. major L.）與車前草（P. asiatica L.）萃取物的生物活性
SpeciesUsed partAreaBiological activities Ref.
Plantago majorDried leafGuatemalaAnti-Bacillus subtilis, Staphylcoccus aureusCaceres, A., et al., 1987
Entire plantSouthern ItalyDiuretic, cholagogue, renal calculosisDe Feo, V., et al., 1993
Entire plantSouthern ItalyNettle-rashDe Feo, V.,et al., 1993
Entire plantIndianAnti-bacterial（Staphylcoccus aureus, Streptococcus pyogenes, D. pneumoniae）, anti-fungal, anthelminthicNaqvi, S.A.H., et al., 1990
Entire plantChileanDiabetes, diuretic, anti-inflammatory, astringentRodriguez, J., et al., 1994
Entire plantSwedish（some）Inactive（Platelet activity factor inhibition）Inactive（Prostaglandin synthesis inhibition）Tunon, H., et al., 1995
Entire plantBritish ColumbianAnti-fungal, inactive（Aspergillus, Microsporum, Trichoderma, Trichophyton,）weakly（Fusarium, Candida） McCutcheon, A.R., et al., 1995
Entire plantFranceOphthalmic, vulneraryNovaretti, R., et al., 1990
LeafFranceAnti-cystitis, anti-inflammatory, anti-diarrhealNovaretti, R., et al., 1990
Fresh leafFranceHaemostaticNovaretti, R., et al., 1990
Fresh leafSouthern ItalyAnti-haemorrhagic, heal woundsDe Feo, V., et al., 1992
Fresh leafSouthern ItalyCholagogue, renal calculosis, bronchial catarrh, treat hemorrhoids,heal wounds, sores and ulcersDe Feo, V., et al., 1992
Entire plantTaiwanTreatment hepatitisLin, C.C., et al., 1990
Entire plantTaiwanPyretic, diuresis, ophthalmic, hepatitis, wound healing, respiratory tract, urinary tract, digestive tract infectious diseases, expectorant1.鄭元春,民852.中國生草藥發展中心 , 民65-66
Plantago asiaticaEntire plantTaiwanTreatment hepatitisLin, C.C., et al., 1990
Dried seedTaiwanLiver diseasesYang, L.L., et al., 1987
Entire plantChina, Indian, South ArnericaAngiotensin-converting enzyme inhibitionHansen, K., et al., 1995
Entire plantTaiwanPyretic, diuresis, expectorant, antiulcer, ophthalmic, respiratory tract and digestive tract infectious diseases高木村,民85
表C車前科植物種子與全草之比較
Semen PlantaginisHerba Plantaginis
基源為Plantaginaceae車前科植物車前Plantago asiatica Linne及同屬植物之乾燥成熟種子為Plantaginaceae車前科植物車前Plantago asiatica Linne及同屬植物之乾燥全草
藥理作用1.Induce Interferon2.促進尿酸排泄：為Aucubin之作用3.利尿作用：增加水分、尿素、尿酸及氯化鈉的排除4.使結締組織增生，使鬆弛囊恢復緊張，可治滑膜炎症： 促結締組織增生，而使鬆弛囊恢復緊張5.對心血管的作用：大劑量則可引起心臟麻痺，血壓降低1.利尿作用：增加水分、尿素、尿酸及氯化鈉的排除2.抗菌作用：抑制金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌3.去痰作用：影響氣管分泌物4.平喘作用：對抗氯化乙烯膽鹼所致的氣管平滑肌的收縮作用5.抗癌症作用6.促進腸管及子宮蠕動7.對心血管的作用：大劑量則可引起心臟麻痺，血壓降低
功能主治為消炎、利尿、鎮咳藥。能化痰、清熱、明目；治小便不利、淋濁、帶下、血尿、中暑下痢、咳嗽多痰、目赤、小兒單純性消化不良、高血壓為消炎、止血、鎮咳藥。能清熱、利尿、明目、去痰；治小便不通、淋濁、帶下、血尿、黃疸、下痢、水腫、鼻血、目赤、咳嗽、腫痛、慢性支氣管炎
性味甘、微寒甘、微寒
歸經肝、腎、肺、小腸肝、腎、肺、小腸
參考文獻：林俊清, 民76; 黃康泰, 1997
材料及方法
壹、車前屬生藥的萃取：
1.1、生藥採集和鑑定：
從高雄地區採集的車前草及大車前草，是請本校生藥專家林俊清教授鑑定無誤後，開始進行研究。
1. 2、生藥的萃取：
將採集的車前草及大車前草全草，乾燥後秤取100g，加入1公升逆滲透壓（R.O.）水，於90℃連續煮兩個小時，為避免因冷卻所導致的結晶現象產生，趁熱以紗布過濾，利用減壓濃縮方法取得萃取物之濃縮液，再經過冷凍乾燥得到生藥粉末，將其分裝（每瓶為20 mg），置於冰箱4℃。每次使用時再新鮮配製稀釋為待測之濃度。
貳、 試藥：
據文獻（Duke, J.A., 1992）得知車前草及大車前草的相關純品計有：Aucubin、Baicalein、Baicalin、Chlorogenic acid、Luteolin等五種（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.），Caffeic acid、Ferulic acid、Linalool、Oleanolic acid、p-Coumaric acud、Ursolic acid、Vanillic acid等七種（Sigma chemical Co, U.S.A.），均稱取2 mg，視成分溶解特性分別溶於60％酒精、medium或溶於Dimethylsulfoxide（DMSO，Sigma）內，使用時依實驗所需再稀釋至使用的濃度。
標準品：5-Fluorouracil, Acyclovir和2’3;-Dideoxycytidine（ddC）（Sigma）溶於DMSO。
參、細胞的培養：
3.1、人類血癌細胞（leukemia）的培養：
使用RPMI-1640添加10% 胎牛血清、100 units/ml penicillin G，100μg/ml streptomycin 及0.25μg/ml amphotericin B，200mM L-glutamine（Gibco BRL）之培養液來培養5種懸浮性的人類血癌細胞株，包括K562（ATCC CCL243）、U937（ATCC CRL1593）、P3HR1（ATCC HTB62）、HL-60（ATCC CCL240）及CCRF-CEM（ATCC CCL119）。培養時置於37℃、5%CO2恆溫培養箱（Forma Scientific）中培養。
3.2、固形性癌細胞的培養：
同樣使用RPMI-1640添加10 % 胎牛血清，100 units/ml penicillin G，100μg/ml streptomycin 及0.25μg/ml amphotericin B ，200mM L-glutamine的培養液，來培養由本實驗室所建立的人類細胞株皮膚基底癌細胞株BCC-1/KMC（Chiang, L.C., et al., 1994）、腎臟癌細胞株RTCC-1/KMC（Chiang, L.C., et al., 1996）、口腔癌細胞株OSCC-1/KMC（Chiang, L.C., unpublished data）及骨癌細胞株U2OS（ATCC HTB96）、子宮頸癌細胞株HeLa（ATCC CCL2）、胃癌細胞株AGS（ATCC CRL1739）、肺癌細胞株H520（ATCC HTB182）、肺癌細胞株H661（ATCC HTB183）、膀胱癌細胞株J82（ATCC HTB1）等9株固形性癌細胞，培養於37℃、5% CO2恆溫箱中。
肆、 抗癌活性的測定：
4.1、人類血癌：
在懸浮性血癌細胞方面，依不同細胞株的不同生長速度，調整實驗用適當的細胞數，如K562 （1 ×105/ml）、U937 （1.2 ×105/ml）、P3HR1 （1.4 ×105/ml）、CCRF-CEM（1 ×105/ml）及HL-60 （1 ×105/ml）。均加90ml之細胞至96-well盤的每個well內（陳祈成, 民89；Chang, J.S., et al., 2001）；再加入10ml各種濃度之大車前草、車前草生藥或純品及標準對照品（5-Fluorouracil），每種濃度作三重覆。96-well盤放置在37℃恆溫系統，5%CO2的培養箱中培養三天。然後將XTT kit II（Roche Diagnostics GmbH, Germany）的（2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-[(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide（XTT：labeling reagent）5ml與PMS（Phenazine methosulfate：electron coupling reagent）100μl混合後，每孔加入50ml，再放進37℃、5% CO2的恆溫培養箱內，經2-4小時反應後，利用ELISA reader（Multiskan EX, Labsystems）測492 nm和690 nm吸光值，並求出OD492-OD690之值。每盤96-well均需做空白細胞對照組及標準藥5-Fluorouracil對照組。
4.2、人類固形癌：
在附著性癌細胞株方面，同樣調整成細胞數（1×105/ml），加入90ml細胞液後便先置於37℃，5% CO2的恆溫培養箱內，等細胞附著後，同上述依序加入10ml的測試樣品及5-Fluorouracil，培養3天後加XTT，再以ELISA reader判讀。毒殺細胞之抑制百分比同樣均以下列公式來計算：
抑制%＝{100－[（ODT / ODC）×100]} %
ODc表不加測試樣品的對照組細胞吸光值（OD492-OD690）
ODT表加入各種測試樣品的實驗組吸光值（OD492-OD690）
所得的抑制百分比，對照其濃度，可求出毒殺50%細胞所須濃度，即IC50值（Scudiero, D.A., et al., 1988；Chang, J.S., et al., 2001）。
4.3、對正常細胞毒性之測定：
血液的獲得：新鮮人血取自高雄捐血中心之血袋，等量的全血與PBS充分混合後，放在Ficoll-Hypaque（Sigma）溶液上面，在25℃以400g離心30分鐘，回收界面淋巴球，再以PBS洗三次，並用RPMI 1640 培養基調整細胞數為4 ×106 cell/ml，96-well培養盤每洞加入90 ml細胞，再分別加入各種濃度的測試樣品，每種濃度作三重覆，其餘步驟與上述相同。利用上述公式求算出毒殺50 %正常細胞所須濃度，即CC50。
4.4、選擇指數（Selectivity Index, SI）：
可做為有無治療價值之參考，及副作用的參考指標，其SI值以下列公式計算（Hu, J.M. and Hsiung, G.D., 1989）：
SI ＝ CC50 / IC50
伍、 抗病毒活性的測定：
5.1、病毒種類：
疹病毒（Herpesvirus，HSV）有兩種：HSV type 1（strain KOS）及HSV type 2（strain 196）。腺病毒（Adenovirus，ADV）有臨床分離病毒株三種：ADV-3、ADV-8及ADV-11。
5.2、病毒的培養：
培養病毒的細胞，採用由本實驗室所建立的細胞株人類皮膚基底癌細胞株BCC-1/KMC細胞，培養於培養瓶內約7∼8分滿時，加入350μl的病毒原液（HSV or ADV）和等量RPMI-1640，在37℃感染1小時後，再添加與平時培養細胞時等量的含2%胎牛血清的RPMI-1640培養液，培養於37℃、5% CO2恆溫箱中，每日觀察細胞病變現象cytopathic effect （CPE）。若於顯微鏡（Olympus）下見細胞脫離達75%，則可收集此培養液，置於-70℃冷凍櫃（Forma Scientific）。取用時，以物理性方法進行冷凍解凍三次，打破細胞膜，游離出成熟病毒。接著以4℃，2500g速度離心5分鐘，收集這些含病毒上清液，分裝後置於-70℃冷凍櫃保存備用。
5.3、病毒的定量：
BCC-1/KMC細胞用Trypsin（Gibco BRL）處理後，定量（100ml of 105 cells/ml）加入96-well內，於37℃、5% CO2培養箱中培養一天後；將病毒原液連續稀釋（10-1∼10-8）後，每一稀釋濃度取100ml病毒液接種到每個洞內，每一個稀釋濃度做4重複。然後在培養箱中培養三天，觀察其細胞感染病毒後有無細胞病變現象（CPE）並記錄。計算的方法是參考Reed and Muench（1938）的方法算出比例距（proportionate distance, PD）：PD=（＞50%死亡率－50%死亡率）/（＞50%死亡率－＜50%死亡率）。再以log值運算求出TCID50（50% tissue culture infective dose），1單位TCID50，表示有50%細胞被感染而產生細胞病變的病毒濃度。本研究各病毒採用之TCID50量是選用會造成無抗病毒藥處理之病毒對照組，與無病毒和測試藥之細胞對照組比較下，OD 492吸光值減少50%之值（Weislow, O.S., et al., 1989），故進行抗病毒活性測試時所用病毒濃度為HSV-2和ADV-8用20 TCID50，HSV-1用25 TCID50，ADV-3和ADV-11則分別用120及200 TCID50。
5.4、各種待測樣品對細胞毒性（CC50）之測定：
實驗步驟同抗癌細胞活性篩選，BCC-1/KMC細胞1 ×105 cell/ml在96-well培養盤中培養5小時，等細胞附著後吸除培養基後不加入病毒感染，而是加入不同濃度的待測檢品或對照標準品（ddC或Acyclovir），培養三天後加入XTT試劑，三小時後測OD492和OD690之吸光值，並計算毒殺50%細胞濃度（CC50）（Kodama, E., et al., 1996）。
5.5、抗病毒活性的測定方法：
首先取1 ×105 cells/ml的BCC-1/KMC放入96-well培養盤中100μl/well，培養一天，吸掉培養基後加入適當量的測試病毒感染1小時，再加入不同濃度的待測檢品或對照標準品ddC（2’,3’-dideoxycytidine）或acyclovir（Acycloguanosine）（Sigma）；培養三天後加入XTT試劑，三小時後測OD492和OD690之吸光值，並計算抑制病毒的百分比，求得保護細胞50%免被病毒感染致死的有效濃度（ED50）。選擇指數（SI）之測定依公式：SI = CC50 / ED50計算之（Hu, J.M. and Hsiung, G.D., 1989；Kodama, E., et al., 1996）。
5.6、抑制病毒繁殖的劑量效應（Dose response）：
同抗病毒活性的測定方法，將BCC-1/KMC細胞1 ×105 cell/ml 放入96-well培養盤中100μl/well培養5小時，然後分成兩個時段進行實驗：（1）同時加入病毒與藥物；（2）感染病毒後分別在1小時、2小時加入分別為1、5、20、40、50μg/ml藥物，培養三天後加入XTT試劑，三小時後測OD492和OD690之吸光值，並計算抑制病毒的百分比，求得保護細胞50%免被病毒感染致死的有效濃度（ED50），並瞭解抑制病毒繁殖的劑量效應。
5.7、病毒感染的時間效應（Time course）之分析：
同抗病毒活性的測定方法，將BCC-1/KMC細胞1 ×105 cell/ml 放入96-well培養盤中（100μl/well），培養5小時，然後分成三個時段進行實驗：（1）在病毒感染前1或2小時先加藥，要加入病毒感染時先把藥物吸除，再感染；（2）同時加入病毒與藥物；（3）感染病毒後分別在1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時加入藥物，培養三天後加入XTT試劑，三小時後測OD492和OD690之吸光值，並計算抑制病毒的百分比，並找出藥物有效抑制病毒的作用點。
陸、免疫調節活性之測定：
6.1、分離人類週邊血液中淋巴球：
新鮮人血與PBS（pH 7.0）等量稀釋充分混合後，緩緩放入Ficoll-Hypaque液上面，25℃、400g離心30分鐘，回收界面淋巴球，再以PBS洗3次，並用RPMI 1640 培養基調整細胞數為2 ×106 cell/ml。
6.2、淋巴球變形反應（Lymphocyte transformation）：
96-well培養盤，每well加100 ml人類淋巴細胞，再加100 ml各種濃度的待測檢品或標準品，標準品最終濃度為10 mg/ml Con A（Sigma），5 mg/ml PHA-L（Seromed, Biochrom KG Leonorenstr. Berlin）。每種濃度均做三重覆，37℃，5% CO2恆溫箱中培養3天後，以5-Bromo-2’-deoxy-uridine labeling and detection kit III（Roche）測DNA合成量，即依照使用說明書，在每個well加20 ml BrdU（5-Bromo-2’-deoxyuridine），培養12小時，然後在4℃、300g離心10分鐘，回收上清液，置於-70℃下保存以供測定細胞激素之用。原來96 well培養盤經由60分鐘的烘乾後、加200μl固定液、100μl anti-BrdU-POD，PBS洗三次後加100μl受質（tetramethylbenzoidine；TMB），在室溫反應30分鐘後，加入25μl的H2SO4（1N）來終止反應，最後用ELISA reader測450 nm吸光值。
淋巴細胞之增生指數（Transformation Index, TI）以下列公式推算：
TI ＝ ODT / ODC
ODc表不加萃取物測試樣品的對照組細胞吸光值
ODT表加入各種測試樣品的實驗組吸光值
6.3、細胞激素的測定：
取細胞激素IFN-γKit（R & D System, Minneapolis, U.S.A.），將standards配置好為500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、1.95 pg/ml等濃度後，與lymphocyte transformation時收取的上清液各100μl，加入已附著有抗原的96-well內，室溫反應兩小時，使用含防腐劑和表面活性劑的緩衝液來清洗四次，加入anti-IFN-γ-peroxidase（200μl）室溫反應2小時，使用含防腐劑和表面活性劑的緩衝液來清洗四次後加200μl受質（tetramethylbenzidine and H2O2），室溫反應30分鐘後加50μl的H2SO4（2N）終止反應，最後用ELISA reader測450 nm和540nm吸光值。
先以standards吸光值（OD450-OD540）和已知濃度畫出standard curve後，再將實驗組的吸光值和standard curve比對，以求得實驗組的細胞激素濃度。
柒、 統計分析：
利用線性回歸求出IC50，ED50，或CC50，而抑制百分比用chi-square test分析，平均值資料用Student’s t-test分析（楊志良, 1993）。
結果
壹、抗癌活性：
藉由XTT Kit中tetrazolium試劑，經過粒腺體代謝產生橙色可溶性的formazan，經由ELISA reader判讀吸光值，可間接反應出細胞存活狀態（Scudiero, D.A., et al., 1988；Roehm, N.W., et al., 1991）。測試車前科車前屬的車前草、大車前草的粗抽物以及其十二種相關活性成分之體外抑制血癌、固形癌活性，並以選擇指數（Selectivity Index, SI）值來評估有無治療價值、及副作用的大小。
抑制人類血癌方面，使用K562、U937、P3HR1、CCRF-CEM、HL-60等五種血癌細胞株進行測試。實驗結果顯示：大車前草及車前草粗抽物可同時抑制五株血癌細胞，其IC50（50% Inhibitional Concentration）分別介於217.7∼307.7μg/ml與370∼1385μg/ml。經由Student’s t-test，來比較兩種植物的抽出物抑制五種血癌細胞株結果，顯示在K562、P3HR1、CCRF-CEM、HL-60的IC50有顯著的差異（p＜0.05）（圖1）。
6類12種相關成分中Aucubin、Ursolic acid、Linalool為車前草的三種成分，屬於monoterpenoid的Linalool，不但可以同時抑制五種人類血癌細胞株（K562、U937、P3HR1、HL-60、CCRF-CEM），並且在抑制U937時的IC50為3.51μg/ml；SI為592.6，及抑制P3HR1 IC50為4.21μg/ml，SI為494.1，均表現出不錯的抑制活性及很高的參考選擇指數，但在抑制K562時效果則較差，IC50在39.43μg/ml，SI為52.75（表1A, 1B）。同時存在於車前草及大車前草的成分：triterpenoid的 Ursolic acid 其抑癌活性最好，尤其在抑制P3HR1時有不錯的抑制活性（IC50：2.50μg/ml；SI：262.6），其次是對K562（IC50：17.79μg/ml；SI：36.91），抗U937無明顯效果（IC50：146.22μg/ml；SI：4.49）（表1A, 1B）。屬於iridoid glycoside的Aucubin無明顯抑制血癌活性，僅對K562細胞株有活性，其IC50在26.39μg/ml，但是SI值僅為1.69（表1A, 1B）。
另外，大車前草所含成分有triterpenoids（oleanolic acid、ursolic acid）、flavonoids（baicalin、baicalein、luteolin）、benzoic compound（vanillic acid）及phenolic compounds（caffeic acid、chlorogenic acid、ferulic acid、p-coumaric acid）等，在抑制血癌方面以flavonoids較佳，效果較好的是化合物Baicalin，可同時抑制五種血癌細胞株，其抗癌活性依序是P3HR1＞K562＞HL-60＞U937＞CCRF-CEM。抗癌效果較佳者有P3HR1（IC50：9.06μg/ml；SI：10.77），K562（IC50：16.43μg/ml；SI：5.94），HL-60（IC50：18.62μg/ml；SI：5.24）U937（IC50：19.47μg/ml；SI：5.01），但在抗CCRF-CEM的效果不佳（IC50：71.58μg/ml；SI：1.36）。另外兩種活性均不佳：Luteolin抗癌活性依序是K562＞P3HR1＞HL-60等三株血癌細胞株。Baicalein同樣也可抑制三株血癌細胞株，活性是CCRF-CEM＞P3HR1＞U937，但效果均差（表 2A, 2B）。
抑制人類固形癌方面：使用BCC-1/KMC （皮膚基底癌細胞株）、RTCC-1/KMC（腎臟癌細胞株）、OSCC-1/KMC（口腔癌細胞株）、U2OS（骨癌細胞株）、HeLa（子宮頸癌細胞株）、AGS（胃癌細胞株）、H520（肺癌細胞株）、H661（肺癌細胞株）、J82（膀胱癌細胞株）等九種固形癌細胞，測試車前屬生藥及6類12種相關成分抗癌活性。大車前草的粗抽物有抑制九種固形癌細胞的活性，但效果稍差，IC50值為283∼1809μg/ml。車前草的粗抽物除了無法抑制BCC-1/KMC及H520 之外，可抑制七株固形癌細胞生長，但效果微弱，IC50為399∼1408μg/ml。經由Student’s t-test統計，車前屬植物車前草及大車前草抑制六株固形癌細胞（BCC-1/KMC、RTCC-1/KMC、U2OS、HeLa、H520、OSCC-1/KMC）的活性具有顯著性的差異（p＜0.05）（圖2）。
車前草的三種成分Linalool、Ursolic acid、Aucubin中，Linalool可以殺九株固形癌細胞，並依序為抗HeLa效果最強IC50在0.37μg/ml，SI值為5621；其次為AGS的IC50在14.09μg/ml，SI值為147.6；再者BCC-1/KMC的IC50在14.87μg/ml，SI值為139.9；殺H520的IC50在21.47μg/ml，SI值為96.88；殺U2OS的IC50在21.69μg/ml，SI值為95.9；殺OSCC-1/KMC的IC50在31.83μg/ml，SI值為65.30；殺RTCC-1/KMC，的IC50在40.70μg/ml，SI值為51.11；殺H661的IC50在42.86μg/ml，SI值為48.53；殺J82的IC50在64.40μg/ml，SI值為32.30（表3, 4）。
兩種車前草共有成分中的Ursolic acid可以抑制八株固形癌細胞，效果依序為：H520效果最強IC50在5.22μg/ml，SI值為125.78；其次為HeLa的IC50在10.19μg/ml，SI值為64.43；再者AGS的IC50在10.85μg/ml，SI值為60.52；殺BCC-1/KMC的IC50在14.42μg/ml，SI值為45.53；殺U2OS的IC50在20.51μg/ml，SI值為32.01；殺OSCC-1/KMC的IC50在21.39μg/ml，SI值為30.70；殺RTCC-1/KMC的IC50在25.53μg/ml，SI值為25.72；殺J82的IC50在34.53μg/ml，SI值為19.02（表3, 4）。
大車前草成分屬於flavonoids的Luteolin可以廣效性的抑制九株固形癌細胞，效果最佳的分別為抑制AGS，其IC50為7.07μg/ml，SI為13.79；抗HeLa的IC50為7.72μg/ml，SI是12.70，其餘抗癌的效果則較差，像H661的IC50值在11.66μg/ml，SI為8.36；J82的IC50為19.52μg/ml，SI為4.99（表5A, 6A）。 Baicalein能抑制六株固形癌細胞，其中以抑制HeLa的IC50在9.77μg/ml，SI為39.7；AGS的IC50在16.09μg/ml，SI為24.08及BCC-1/KMC的IC50在19.45
μg/ml，SI為19.92，三株固形癌細胞的效果最佳，而抗H520的效果稍差（IC50＝36.43μg/ml，SI＝10.64）（表5A, 6A）。屬於triterpenes的Oleanolic acid可以廣效性的抑制七株固形癌細胞，其中效果最好的是抑制HeLa 的IC50在13.23μg/ml，SI值為22.97（表5B, 6B）。
貳、抗病毒活性：
針對車前科車前屬的車前草、大車前草的粗抽物以及其六類十二種相關活性成分，測試其體外抗腺病毒及疹病毒活性。
能造成XTT的formazan產物減半時的病毒量，分別是HSV-1（25 TCID50），HSV-2（20 TCID50），ADV-3（120 TCID50），ADV-8（20 TCID50），ADV-11（200 TCID50）。此等為抗病毒活性篩選時的病毒劑量。
車前草的粗抽物可抑制HSV-2及ADV-11病毒感染，ED50（50% Antiviral Effective Dose）值分別在1318及55.80μg/ml（圖3, 表7）。大車前草的粗抽物僅對HSV-2有抑制活性其ED50值為843
μg/ml，與車前草比較在統計上有顯著差異（p＜0.01）（圖3）。
車前草所含的三種成分Linalool、Aucubin、Ursolic acid，皆未顯示有抑制病毒的活性（表7）。
大車前草的九種成分，除Luteolin、Oleanolic acid及Ursolic acid等三種外，其餘的六種成分皆可有效的抑制疹病毒或是腺病毒感染。其中phenolic compounds的Chlorogenic acid具有抑制上述五種病毒的活性，其中以抗ADV-11最好，其ED50為13.29μg/ml，SI值為300.6，而抗HSV-1的ED50為47.6μg/ml，SI值為83.93；ADV-3的ED50為75.98μg/ml，SI值為52.58；HSV-2的ED50為86.45μg/ml，SI值為46.21；ADV-8的ED50為108.4μg/ml，SI值為36.85；其它phenolic compounds：（1）Caffeic acid可以抗HSV-1、HSV-2及ADV-3，尤其以抗ADV-3的效果最好，其ED50為14.16μg/ml，SI在726.9，其次為抗HSV-2、HSV-1的ED50分別為87.25μg/ml，SI值為118與ED50為15.34μg/ml，SI值為671；（2）Ferulic acid對ADV-8及ADV-11兩種病毒，亦略有抑制活性；（3）p-Coumaric acid毒殺抑制病毒及腺病毒也有些效果，在抑制HSV-2的ED50為32.82μg/ml，SI為14.89，抑制ADV-11的ED50為43.79μg/ml，SI為11.16；flavonoids的Baicalein及Baicalin雖然分別可抑制HSV-1及HSV-2，但抑制活性稍差（表8, 9）。
上述結果顯示十二種成分中，以Caffeic acid抗病毒活性最強，因此，選擇Caffeic acid進行抑制HSV-1感染的劑量效應（dose-dependent antiviral effect）實驗。
感染HSV-1、ADV-3後的0∼2小時加入不同濃度Caffeic acid，結果顯示抗HSV-1的ED50為15.34±0.91μg/ml，抗ADV-3的ED50為25.13±4.01μg/ml，同時並顯示Caffeic acid對HSV-1呈現劑量效應（圖4）。
由於Caffeic acid能同時抑制疹病毒和腺病毒，因此以此成分進一步實驗，以找出Caffeic acid如何抑制病毒感染的作用機轉。進行時間效應實驗時，從加病毒前2小時到加病毒後24小時之間加入不同濃度的Caffeic acid，結果顯示在HSV-1及ADV-3感染BCC-1/KMC之前1小時、2小時先分別加入1、5、20、40或50μg/ml的Caffeic acid，對HSV-1或ADV-3並無顯著抑制病毒生長的活性，但是同時感染，或感染後才加藥，則可明顯抑制病毒感染（圖5, 6）。
參、免疫調節活性：
進行Lymphocyte transformation時，以BrdU 併入到合成的DNA來取代以往有放射線傷害的3H-thymidine，測試大車前草、車前草之粗抽物及十二種相關成分，是否有刺激週邊血液單核細胞（PBMC）的DNA合成現象，來評估正常人類淋巴球的增生情形，並將上述實驗後所收集到的上清液，定量誘生分泌IFN-γ的量。
大車前草及車前草的粗抽物，兩者在25μg/ml呈現刺激PBMC的DNA合成量最高，TI（Transformation Index）分別為1.26和2.32，而在最高濃度200μg/ml時，反而是抑制最強的情形。與細胞對照組比較，大車前草及車前草之粗抽物在12.5、25、50μg/ml時，都具有顯著促進PBMC合成DNA（p＜0.05）（圖7）。
比較大車前草與車前草的粗抽物，在12.5μg/ml低濃度時都沒有看到IFN-γ的產生，而車前草在25μg/ml時，會誘使IFN-γ產生38.14 pg/ml；在濃度50μg/ml時刺激IFN-γ產生的量分別為大車前草44.71 pg/ml、而車前草56.72 pg/ml（圖8）。
在6類12種相關成分中，促進PBMC的DNA合成以phenolic compound類的p-Coumaric acid的表現最佳，在1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml的TI值分別為1.358、1.737、1.825、2.288、4.95、2.954，特別在20μg/ml刺激大量的DNA合成，其TI為4.95，而且產生IFN-γ181.24 pg/ml，在1.25μg/ml刺激微量的DNA合成，其TI為1.35，但是產生IFN-γ127.8 pg/ml（圖9, 10）。
Ferulic acid刺激PBMC的DNA合成活性，呈現藥物劑量效應，即藥物濃度愈高，刺激DNA合成的量愈多，然而IFN-γ的產量卻相反，即藥物較高濃度時誘生IFN-γ的量反而較少。Chlorogenic acid除了40μg/ml呈現抑制（TI＜1）外，其餘五個濃度是促進的（TI＞1），以2.5μg/ml時刺激最多的PBMC DNA合成，其TI為1.55，誘生的IFN-γ只有44.38 pg/ml。Caffeic acid同樣在2.5μg/ml有最高的TI值為1.59，但是IFN-γ只有5.71 pg/ml，在20、40μg/ml時反而呈現抑制的現象（圖9, 10）。
另外，iridoid glycoside的Aucubin在5μg/ml時，刺激大量PBMC的DNA合成，其TI為4.027、IFN-γ有120.48 pg/ml；monoterpenoid的Linalool在40μg/ml的TI有1.557、IFN-γ有52.95 pg/ml；benzoic compound的Vanillic acid在10μg/ml的TI有4.002、IFN-γ有68.38 pg/ml，以上三種成分都呈現在高濃度下刺激較大量的DNA合成，但是IFN-γ誘生量卻較少（圖11, 12）。
Triterpenoid的Ursolic acid在40μg/ml時表現促進PBMC的DNA合成量最多，其TI值為1.19、誘生IFN-γ203.7 pg/ml。另一成分Oleanolic acid在20μg/ml時，其TI值1.12，誘生IFN-γ258.0 pg/ml（圖13, 14）。
Flavonoid的Baicalin在1.25∼20μg/ml均可以刺激PBMC的DNA合成，尤以1.25μg/ml時表現出最高TI值為1.729，除了在最高濃度（40μg/ml）是抑制的外，其餘的濃度均是促進的，而Baicalein在1.25∼40μg/ml間，均能促進PBMC的DNA合成，相反的，Luteolin卻完全表現抑制作用（圖15）。Baicalein、Baicalin在低濃度時刺激PBMC分泌較大量IFN-γ，但高濃度時反而分泌量較少，如 Baicalein在1.25μg/ml及Baicalin1.25μg/ml時分別誘生IFN-γ的量為151.78 pg/ml與116.98 pg/ml。在較高濃度40μg/ml的Baicalin與5μg/ml的Baicalein刺激產生IFN-γ的量分別為83.86和62.71 pg/ml （圖16）。
討論
壹、抗癌活性
由於NCI自1950年末期，在天然藥物作為臨床用藥的研究及開發有不錯的成果（Statz, D. and Coon, F.B., 1976），因此導致許多天然植物的研究成果應用在治療上面（請見緒論）。
1.1 粗抽物抗癌活性
車前屬植物在過去的研究被用來做為醫療的藥材，用於消化道、呼吸系統的治療、傷口的復原，亦具解熱、鎮痛之功效（Samuelsen, A.B., 2000），在1992年Lithander的研究報告指出，將大車前草的水抽物以注射方式給予易患乳腺癌年齡的老鼠時，可以有效預防老鼠乳腺癌的發生（Lithander, A., 1992）。本論文測試車前草及大車前草水抽物抑制人類血癌（leukemia）、固形癌（solid tumors）的試驗發現，粗抽物確實對人類血癌、固形癌皆有抗癌效果（圖1, 2）。
1.2相關成分抗癌活性
黃酮類化合物（Flavonoids）在過去的研究文獻中，曾報導具有抗癌活性，如Baicalin具有抗老鼠腫瘤的活性，有不同程度的抑制性（季宇彬等, 1998）；除了Baicalin外，Baicalein、Wogonin均可抑制人類膀胱癌細胞（KU-1、EJ-1）及老鼠膀胱癌細胞（MBT-2）的增生，並也顯示出dose-dependent現象，以Baicalin的表現尤其明顯（Ikemoto, S., et al., 2000）；Baicalin、Baicalein可以抑制人類肝癌細胞（PLC/PRF/5、Hep-G2）、人類胰臟癌細胞（BxPC-3）的生長和DNA合成（Motoo, Y., and Sawabu, N., 1994）；Luteolin可以抑制數種固形癌：腎癌（A-549）、卵巢癌（SK-OV-3）、黑色素癌（SK-MEL-2、XF-498、HCT-15）、胃癌（HGC-27）（Matsukawa, Y., et al., 1993），腹水癌（NK/LY）（Molnar, J., et al., 1981）及血癌（P388, CEM-C1 and CEM-C7）（Chen, J., et al., 1992）。有抗癌活性藥物Genistein，是一種flavone的類似物，是特異性tyrosine kinase及topoisomerase II的抑制劑，使細胞週期停在 G2-M期，而Luteolin及構造類似物卻使細胞週期停於G1期，（Matsukawa, Y., et al., 1993）；上述研究顯示flavonoids的抗癌活性，亦可由本論文的下列實驗結果得到更進一步的佐證。
6類12種相關成分在抑制人類血癌活性方面，以flavonoids（baicalin, luteolin）、triterpenoids（oleanolic acid, ursolic acid）及monoterpenoid（linalool）的抗人類血癌活性較佳：Baicalin及Linalool可以抗五種人類血癌細胞，具廣效性抗人類血癌的活性；而Luteolin可抑制K562、P3HR1（IC50＜20μg/ml，SI＞5）僅次於Baicalin和Linalool（表1B, 2B）。抑制固形癌活性方面，同樣也是flavonoids（baicalein, luteolin），triterpenoids（ursolic acid, oleanolic acid）及monoterpenoid（linalool）的表現最好，其中Luteolin、Linalool可同時抗九種固形癌細胞，也具廣效性抗固形癌活性。Baicalin及Ursolic acid可同時抗BCC-1/KMC、AGS、HeLa（IC50＜20μg/ml，SI＞5），而Oleanolic acid毒殺HeLa具有最強活性，其IC50為13.23μg/ml，SI在22.97（表3∼6）。
Triterpenoid的Ursolic acid及同分異構物Oleanolic acid，已知有種種生物活性，顯示可能抑制腫瘤發展的不同階段（Shibata, S., 1994；Suh, N., et al., 1998）；最近由Hsu等人發表Oleanolic acid及Ursolic acid會抑制7-8週大的ICR老鼠腫瘤的生長，及增進被放射線傷害的造血系統的恢復（Hsu, H.Y., et al., 1997）；Ursolic acid使HL-60內Ca++的增加，誘發HL-60進行apoptosis（Baek, J.H., et al., 1997）。
Triterpenoid的Ursolic acid比Oleanolic acid有更強抑癌的活性，Ursolic acid不論是在人類血癌的K562（IC50：17.79μg/ml，SI：36.91）與P3HR1（IC50：2.50μg/ml，SI：262.6）或是固形癌BCC-1/KMC（IC50：14.42μg/ml，SI：45.53），AGS（IC50：10.85μg/ml，SI：60.52），HeLa（IC50：10.19μg/ml，SI：64.43），H520（IC50：5.22μg/ml，SI：125.78）均表現IC50小於20μg/ml，SI大於30，顯示有很好的抗癌活性（表2B, 6B）。
Monoterpenoid的Linalool在過去的文獻報告，顯示抑制真菌（Candida albicans）、細菌（Escherichia coli、Staphylococcus aureus）的作用（Carson, C.F. and Riley, T.V., 1995）。本論文結果顯示Linalool能抑制人類血癌（K562、U937、P3HR1）和固形癌細胞（BCC-1/KMC、AGS、HeLa）的IC50小於20μg/ml，SI大於50，因此有很好的抗癌活性（表1B, 4）。
大車前草、車前草及各個相關成分有抗癌的活性。因此推測大車前草或車前草之活性較強的相關成分flavonoids、triterpenoids或monoterpenoid，可能是車前屬生藥抗癌的活性成分之一，是否還有其它抗癌活性成分，則有待將來更進一步研究。
貳、抗病毒活性
2.1 粗抽物抗病毒活性
大車前草乙醇萃取物對herpes和polio virus無抑制作用（Suganda, A.G., et al., 1983），另外用甲醇萃取物也無抗病毒活性（McCutcheon, A.R., et al., 1995）。車前草、大車前草在民間有用於治療急性結膜炎（高木村, 民85；莊兆祥等編, 1981），或用於保護肝臟免受到化學藥劑的損傷（Aktay, G., et al., 2000）。本論文用熱水萃取方式，車前草粗抽物可抑制HSV-2、ADV-11，大車前草粗抽物可抑制HSV-2（圖 3, 表7）。
2.2 相關成分抗病毒活性
Bourne等人研究報告指出Caffeic acid抑制HSV-2的ED50為0.54 mg/ml，Ferulic acid的ED50為8 mg/ml（Bourne, K.Z., et al., 1999），而在本實驗的結果，Caffeic acid抗HSV-2的ED50為87.25μg/ml，而Ferulic acid並沒有抑制HSV-2的效果（表9）。比較本實驗與Bourne報告之差異可能在於（1）養病毒之細胞不同，分別為HeLa與BCC-1/KMC；（2）定量病毒之方法不同，分別採用plaque、TCID50導致接種的病毒量不同；或是（3）測試方法不同所導致。
現今已有不少報告聲稱許多植物成分有抗病毒的活性，如前面緒論。有文獻報告5-iodo-2’-deoxyuridine（IDU）及ganciclovir（GCV）這兩種已知抗疹病毒的藥被使用在治療腺病毒感染，但藥物毒性較高，而且SI值只有3.4及2.1（Gordon, Y.J., et al., 1991；Kodama, E., et al., 1996）；近幾年數種新合成用來抑制腺病毒複製的核類似物如（S）-HPMPA、（S）-HPMPC、S-2242，其SI值分別為70.2、11.0和292.2，雖然SI值大大的提高了（Kodama, E., et al., 1996），但是仍然是合成的核類似物。
在本論文實驗用來做為對照組的也是臨床上最常用來做為抗疹病毒的Acyclovir抗HSV-1的SI值為94，抗HSV-2的SI值為117.8，而Caffeic acid抗HSV-1的SI值為671（標準品Acyclovir的7.14倍），抗HSV-2 的SI值為118，和標準品相當（表9）。
試驗中能有效抑制腺病毒的2’,3’-dideoxycytidine（ddC）在抑制ADV-3、ADV-8、ADV-11的SI值分別為43.0、22.9、16.35，仍都不如本實驗中phenolic compounds的抗腺病毒活性，如Caffeic acid抗ADV-3最佳，SI為726.9大於ddC 10倍以上；Chlorogenic acid抗ADV-11最佳，SI值為300.6，其抗腺病毒活性大於ddC 18倍以上，而且Chlorogenic acid具有廣效抗病毒活性，對HSV-1、HSV-2、ADV-3、ADV-8和ADV-11等五種病毒，均有抑制活性（表9）。由本論文的實驗結果顯示在體外（in vitro）有抗疹、抗腺病毒的活性，因此值得將來進一步進行體內（in vivo）活性研究。
因此推斷，車前草及大車前草的熱水萃取物有抗病毒活性，而可溶於水的phenolic compounds可能是其活性成分之一，至於水抽物抗病毒活性不強，可能是因為上述成分在水抽液中的含量太低所致。
2.3 抗病毒的作用點
Caffeic acid在五個不同的濃度下測試抗HSV-1、ADV-3活性，以便找出其抑制病毒的作用點，結果分別在三個不同的時間加藥，抗HSV-1呈現dose-dependent的情形，ED50為15.34μg/ml，且在40μg/ml時可100%的抑制HSV-1（圖4）。
另外，從同時感染及感染後1∼12小時，都見到可抑制HSV-1病毒（圖5），腺病毒也在同時感染及感染後1∼12小時，也可見到抑制病毒，而尤其以感染後的兩個小時內抑制活性最強（圖6）。一般來說，病毒在感染後5∼6小時病毒複製開始成對數的增加（圖 5B, 6B），直到感染後十七個小時（Chanock. R.M., et al., 1990）。由本實驗結果推測Caffeic acid抗疹病毒感染後的複製，並非在阻止病毒的吸附而是抑制病毒複製；至於腺病毒同樣在於抑制病毒的複製，只是作用於複製的早期（圖6），因此Caffeic acid在抗疹病毒及抗腺病毒時，雖不具有預防效果但具有很不錯的治療效果。
參、免疫調節的活性
3.1 粗抽物免疫調節活性
回顧近年數篇關於免疫調節方面的研究報告後得知，1997年Basaran等人發現大車前草具有吸引neutrophils的活性，但不能增加neutrophil內的毒殺活性（Basaran, A.A., et al., 1997）。此外，2000年時Rezaeipoor等人利用車前屬P. ovata種子的水抽物，可以抑制初級的體液性免疫反應，可能是抑制B cell而不是T cell（helper）功能（Rezaeipoor, R., et al., 2000）。同年Gomen-Flores等人將P. major的甲醇抽出物給予老鼠，可以藉由活化macrophages而產生nitric oxide及TNF，結果並呈現劑量依賴效應（Gomez-Flores, R., et al., 2000）；由P. major分離的多醣類（polysacch
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