臺灣博碩士論文加值系統

維生素E衍生物—生育酚琥珀酸酯α-tocopheryl succinate (α-TOS)具有誘導癌細胞產生細胞凋亡，同時對正常細胞低毒性之特性。本研究以團聯聚合物methoxypoly(ethylene glycol)-block- poly(hydroxypropyl methacrylate) (mPEG-b-PHPMA)，接枝上疏水性的α-TOS及具有酸鹼應答功能之組氨酸(histidine)，形成梳狀高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His) (P-T-His)。此高分子以自組裝方式形成奈米微胞，並做為同時承載抗癌藥物doxorubicin及α-TOS之藥物載體。
高分子奈米微胞由粒徑分析儀得知其粒徑大小為166.0±29.6 nm，PDI為0.157±0.007。在藥物釋放行為的分析中，P-T-His載藥微胞展現了良好的酸鹼應答性。細胞實驗中亦證實微胞本身對小鼠纖維母細胞(L929)和人類結腸癌細胞(HCT116)不會造成毒性；載藥微胞則可有效地抑制癌細胞的生長。藉由流式細胞儀之分析可看出P-T-His微胞有效地被大腸癌細胞HCT116吞噬，而從共軛焦雷射掃描顯微鏡則觀察出隨著時間的增加載體可將藥物運送至細胞核中，執行毒殺癌細胞之目的。在動物實驗中，亦可觀察到載體大量累積於腫瘤組織的現象，因此，綜合上述實驗結果，本研究之P-T-His高分子微胞具有良好的潛力發展成為應用於癌症治療中之藥物載體。

關鍵詞：生育酚琥珀酸酯、組氨酸、酸鹼應答型微胞

α-Tocopheryl succinate (α-TOS), an analogue of vitamin E, can induce apoptosis in cancer cells, while exhibiting low toxicity in normal cells. In this study, the block copolymer, methoxy poly(ethylene glycol)-block-poly (hydroxypropyl methacrylate) (mPEG-b-PHPMA) was designed as the hydrophilic main chain. The hydrophobic α-TOS and pH-sensitive histidine were grafted onto the block copolymer by coupling reaction, forming comb-like copolymer, mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g- His). The copolymers were self-assembled into polymeric micelles which loaded with both anticancer drug, doxorubicin, and apoptosis-induced agent, α-TOS.
According to the measurement of dynamic laser scanning (DLS), the particle size of the polymeric micelles was 166.0±29.6 nm and the polydispersity index (PDI) was 0.157±0.007. The drug release profiles showed that the histidine-contained polymeric micelles (P-T-His) exhibited excellent pH-sensitivity. In vitro study indicated that the polymeric micelles P-T-His exhibited very low cytotoxicity to mouse fibroblast cells L929 as well as human colon cancer cell HCT116. Dual drug loaded micelles could effectively inhibit cancer cell proliferation. The results of flow cytometry indicated that P-T-His micelles could be uptaken into colon cancer HCT116 cells. In vivo study has showed that the dual drug-loaded micelles preferentially accumulated in tumor tissues. In summary, the P-T-His micelles encapsulated with α-TOS and Dox possessed the potential for anticancer therapy.

Keywords: α-tocopheryl succinate; histidine; pH-sensitive micelles

中文摘要 i
英文摘要 ii
圖目錄 viii
表目錄 xii
第一章 研究動機 1
第二章 文獻回顧 3
2.1 癌症發生的原因 3
2.1.1 癌症與細胞週期 3
2.1.2 細胞凋亡 4
2.2 藥物傳遞系統於癌症治療之應用 5
2.2.1 應用於癌症治療之奈米載體 6
2.2.2 奈米載體於體內和細胞內傳輸的過程 7
2.2.2.1 奈米載體的主動與被動標靶 7
2.2.2.2 胞吞作用 9
2.2.3 奈米藥物載體之介紹 10
2.2.3.1 高分子微胞 11
2.2.3.2 功能型微胞 13
2.3 高分子材料之性質與應用 15
2.3.1 維生素E衍生物—α-tocopheryl succinate, α-TOS 15
2.3.1.1 α-TOS化學結構之功能 17
2.3.1.2 α-TOS抑制癌細胞生長之機制 18
2.3.1.3 α-TOS於藥物載體之應用 19
2.3.2 Polyethylene glycol, PEG 21
2.3.2 Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide), PHPMA 21
2.3.3 Histidine 23
2.4 抗癌藥物Doxorubicin, Dox 23
第三章 實驗材料與方法 25
3.1 實驗藥品 25
3.2 實驗儀器 26
3.3 名詞對照 28
3.4 高分子之製備與分析 30
3.4.1巨起始劑mPEG2-ABCPA之製備 30
3.4.2 小分子α-TOS-MA之製備 31
3.4.3 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)之製備 32
3.4.4 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)之製備 32
3.4.5 高分子結構分析 34
3.4.5.1 1H-NMR結構鑑定與聚合程度分析 34
3.4.5.2 GPC分子量分佈分析 34
3.4.5.3 FT-IR官能基分析 34
3.5 高分子微胞之製備與分析 34
3.5.1 高分子微胞之製備 34
3.5.1.1 Solvent evaporation method 34
3.5.1.2 Solvent exchange method 35
3.5.2 高分子微胞之粒徑大小及分佈性 35
3.5.3 高分子微胞之型態分析 35
3.5.4 高分子微胞之藥物包覆與分析 35
3.5.4.1高分子微胞之藥物包覆 35
3.5.4.2 高分子微胞之藥物包覆分析 36
3.5.5 載藥高分子微胞之安定性分析 36
3.5.6 載藥高分子微胞之酸鹼應答分析 36
3.5.7 高分子微胞之藥物釋放情形與分析 36
3.5.7.1 Dox釋放行為 36
3.5.7.2 α-TOS釋放行為 37
3.6 高分子微胞之體外測試 (in vitro test) 37
3.6.1 高分子微胞之細胞毒性測試 37
3.6.2 載藥高分子微胞之細胞毒性測試 37
3.6.3 微胞胞吞情形之觀察 37
3.6.3.1 以共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察細胞對微胞之胞吞作用 37
3.6.3.2 以流式細胞儀觀察細胞對微胞之胞吞作用 38
3.7 載藥高分子微胞之體內測試 (in vivo test) 38
第四章 結果與討論 39
4.1 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)及其微胞之性質分析 39
4.1.1巨起始劑mPEG2-ABCPA之鑑定與分析 39
4.1.2小分子α-TOS-MA之鑑定與分析 41
4.1.3高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)之鑑定與分析 43
4.1.4高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)微胞之粒徑分佈及型態分析 45
4.2 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)及其微胞之性質分析 47
4.2.1 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)之鑑定與分析 47
4.2.2高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)微胞之粒徑分佈及型態分析 50
4.3載藥高分子微胞之性質分析 51
4.3.1載藥高分子微胞之粒徑分佈、微胞型態及藥物包覆分析 51
4.3.2載藥高分子微胞之安定性分析 53
4.3.3 載藥高分子微胞之酸鹼應答分析 54
4.3.4 藥物釋放情形與分析 54
4.3.4.1 Dox釋放行為 54
4.3.4.2 α-TOS釋放行為 55
4.4 高分子微胞之體外測試 (in vitro test) 56
4.4.1高分子微胞之細胞毒性測試 56
4.4.2 載藥高分子微胞之細胞毒性測試 58
4.4.3 高分子微胞胞吞作用之觀察 60
4.5高分子微胞之體內測試 (in vivo test) 62
第五章 結論 63
參考文獻 64


圖目錄
圖1- 1 藥物載體之設計與應用示意圖 2
圖2- 1 細胞週期 4
圖2- 2 細胞凋亡之路徑圖 5
圖2- 3 傳統藥物與藥物載體於體內分佈性(左)及血液藥物濃度(右)之 差異性 6
圖2- 4 奈米載體的應用 7
圖2- 5 抗體及非抗體型的主動標靶載體 8
圖2- 6 主動與被動標靶 9
圖2- 7 胞吞作用 10
圖2- 8 常見的奈米藥物載體 11
圖2- 9 微胞的核殼結構 12
圖2- 10 物理性包覆藥物：(a)透析法(溶劑置換法)及(b)水包油乳化法(溶劑揮發法) 13
圖2- 11 (a) L-histidine及(b) pyridine質子化示意圖 14
圖2- 12 以acetal鍵結形成的5-fluorouridine-PEG conjugate 15
圖2- 13 四種維生素E異構物：alpha- (α-)、beta- (β-)、gamma- (γ-)及delta- (δ-)維生素E 及其在血漿中濃度及生物活性 16
圖2- 14 維生素E結構上之三大區域 17
圖2- 15 細胞週期及其調控機制 18
圖2- 16 α-TOS誘導細胞凋亡的路徑 19
圖2- 17 TPGS (左)及TPGS-Dox (右)結構示意圖 20
圖2- 18 CS-TOS結構示意圖 20
圖2- 19 mPEG 5000結構示意圖 21
圖2- 20 HPMA copolymer-Dox conjugates (PK1)及其胞吞作用過程 22
圖2- 21 Doxorubicin結構示意圖 24
圖3- 1 巨起始劑mPEG2-ABCPA合成示意圖 30
圖3- 2 小分子α-TOS-MA合成示意圖 31
圖3- 3高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)合成示意圖 32
圖3- 4高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)合成示意圖 33
圖4- 1 巨起始劑mPEG2-ABCPA之1H-NMR光譜圖 40
圖4- 2巨起始劑mPEG2-ABCPA及其反應物mPEG5000之FT-IR光 譜圖 40
圖4- 3 巨起始劑mPEG2-ABCPA及其反應物mPEG5000之GPC鑑定 圖 41
圖4- 4 α-TOS-MA之1H-NMR光譜圖 42
圖4- 5 小分子α-TOS-MA及其反應物之FT-IR光譜圖 42
圖4- 6 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)之1H-NMR光譜圖 44
圖4- 7高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)及其反應物之FT-IR光譜圖 44
圖4- 8 P10-T4微胞之粒徑分佈圖及TEM影像圖 46
圖4- 9 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-Boc-His)之1H-NMR光譜圖 49
圖4- 10 高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)之1H-NMR光譜圖 49
圖4- 11高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS、mPEG-b-P(HPMA-g- α-TOS-g-Boc-His)及mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)之FT-IR光譜圖 50
圖4- 12 P10-T4-His3微胞之粒徑分佈圖及TEM影像圖 51
圖4- 13 1:1 drug/P10-T4 (A)及1:1 drug/P10-T4-His3 (B)微胞之TEM影像圖 52
圖4- 14 1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3微胞之粒徑變化 53
圖4- 15 1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3 (B)微胞之粒徑分佈變化 53
圖4- 16 1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3微胞於pH4.5環境下之TEM影像圖 54
圖4- 17 1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3微胞於pH 7.4及4.5 PBS環境中之Dox釋放行為 (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001) 55
圖4- 18 1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3微胞於pH 7.4及4.5 混合溶劑PBS: methanol = 1:1 (v/v) 環境中之α-TOS釋放行為 (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001) 56
圖4- 19 不同濃度之α-TOS、P10-T4及P10-T4-His3微胞與小鼠纖維母細胞株(A)(B)及人類結腸癌細胞株(C)(D)於24及48小時共同培養之細胞存活率 57
圖4- 20不同濃度之Dox、α-TOS、1:1 drug/P10-T4及1:1 drug/P10-T4-His3微胞與小鼠纖維母細胞株(A)(B)及人類結腸癌細胞株(C)(D)於24及48小時共同培養之細胞存活率 59
圖4- 21 Dox (A-1及B-1)及1:1 drug/P10-T4-His3(A-2及B-2)微胞於人類結腸癌細胞中胞吞作用之CLSM螢光影像圖 60
圖4- 22 以flow cytometry觀察人類結腸癌細胞對於P10-T4-His3微胞在1 (A)及3 (B)小時共培養下之胞吞作用情形 61
圖4- 23 P10-T4-His3微胞胞吞進入人類結腸癌細胞之相對細胞數目(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001) 61
圖4- 24 P10-T4 (A-1、B-1)及P10-T4-His3(A-2、B-2)載藥微胞於裸鼠的生物分佈情形 62
圖4- 25 P10-T4 (A)及P10-T4-His3(B)載藥微胞的生物分佈情形 62

表目錄
表4- 1不同重覆單位組成之高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS) 45
表4- 2以solvent evaporation method製備不同重覆單位組成之 mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)高分子微胞的粒徑及分佈性 46
表4- 3以solvent exchange method製備不同重覆單位組成之mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS)高分子微胞的粒徑及分佈性 46
表4- 4不同重覆單位組成之高分子mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His) 47
表4- 5以solvent exchange method製備不同重覆單位組成之mPEG-b-P(HPMA-g-α-TOS-g-His)高分子微胞的粒徑及分佈性 51
表4- 6 P10-T4及P10-T4-His3載藥高分子微胞之粒徑、粒徑分佈性、藥物包覆率及藥物含量 52

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