臺灣博碩士論文加值系統

本研究主要係以Monascus purpureus CCRC31499發酵蝦蟹廢棄物，生產多用途之蛋白酶。M. purpureus CCRC31499所生產蛋白酶之最適培養條件為 2% 蝦蟹殼粉、0.15% 聚蛋白月東、0.1% 酵母抽出物、0.05%MgSO4 .7H2O、0.1% K2HPO4於pH7、100mL、37℃條件下，進行振盪培養4天後，可得最大之蛋白酶活性19.1U/mL。
M. purpureus CCRC31499發酵蝦蟹廢棄物所生產蛋白酶，經硫酸銨沉澱、透析後，進行DEAE-Sepharose陰離子交換層析、Sephacryl S-200膠體過濾層析及一連串純化分離的步驟。所純化分離出之蛋白酶純度約為未純化分離前的25倍左右。經純化分離出來之蛋白酶在pH 5∼11之內酵素都能保持穩定狀態，而最適反應溫度及最適反應pH值分別為50℃及pH 9。進行SDS-PAGE電泳分析及Sephacryl S-200膠體層析可知其分子量約為40 kDa左右。此蛋白酶受PMSF（絲胺酸蛋白酶抑制劑）極強的抑制作用，可得知本研究酵素為絲胺酸蛋白酶。
M. purpureus CCRC31499可以經酸處理及以鹼處理的蝦蟹殼粉為碳源來生產蛋白酶，其產量比未處理蝦蟹殼粉為碳源的還要高。當使用酸處理蝦蟹殼粉的時候其最大的蛋白酶產量由未處理過的19.1U/mL增加到21.8U/mL。
將M. purpureus CCRC31499發酵後生產之植物生長促進劑，進行田間試驗，並將其成分特性及實際效果作一比較。結果顯示以M. purpureus CCRC31499效果最佳，其與對照組比較可增加全株長155%，全株重521%。經田間實驗所得到之良好植物生長促進劑，期日後能量產，應用於我國之農業上。

The production of useful protease by Monascus purpureus CCRC31499, using shrimp and crab shell powder as the major carbon source, was studied. The optimized conditions for protease production was found when the culture was shaken at 37℃ for 4 days in 100mL of medium（pH7）containing 2﹪shrimp and crab shell powder, 0.15﹪poly-peptone, 0.1﹪yeast extract, 0.1﹪K2HPO4 and 0.05﹪MgSO4 •7H2O.
The protease of Monascus purpureus CCRC31499, produced under the optimized culture condition, the first step was precipitated and dialyzed by using ammonium sulfate. The further purification and separation procedures of the protease were processed by the use of DEAE-Sepharose ionic exchange chromatography、Sephacryl S-200 gel permeation chromatography and chromatofocusing. Purification was 25-fold with the crude enzyme solution. After purification and separation, the activity of the protease was still stable at pH 5∼11, while the optimal temperature and pH for the enzyme reaction were at 50℃and pH9, respectively. By SDS-PAGE electrophoresis and gel permeation chromatography, the molecular weight of the protease was identified as 40kDa. The activity of protease was strongly inhibited by PMSF, and showed as a Serine protease.
A protease-producing microorganism Monascus purpureus CCRC31499 can use acid or alkaline treated shrimp and crab shell powder（SCSP）induced protease production than untreated SCSP. The enzyme activity was 21.8U/mL when HCl treated SCSP was used, as compared to 19.1U/mL when untreated SCSP was used.
The properties of composts made by bio-fertilizer crab and shell wastes with Monascus purpureus CCRC31499 were studied. The effects of the composts on the growth of Chinese cabbage were observed. The length and fresh weight of the whole plant were grown enormously; they are 155 % and 521 % in comparison with the control. Expect the culture supernatant of Monascus purpureus CCRC31499 is good for field test.

目 錄
封面內頁
簽名頁
授權書 iii
中文摘要 v
英文摘要 vii
誌謝 ix
目錄 x
圖目錄 xv
表目錄 xvii
第一章 緒言 1
第二章 文獻回顧 3
2.1 紅麴 3
2.1.1 紅麴的起源 3
2.1.2 紅麴的特性與分類 4
2.1.3 紅麴的特性 5
2.1.4 紅麴的代謝產物 6
2.2 水產廢棄物 7
2.2.1 水產廢棄物之來源 7
2.2.2 蝦蟹殼粉、幾丁質之利用 7
2.3 蛋白酶 10
2.3.1 蛋白酶的簡介 10
2.3.2 蛋白酶的分類依據與其命名 11
2.3.3 蛋白酶的作用機制 13
2.3.4 蛋白酶的一般性質 16
2.3.5 蛋白酶的應用 19
2.3.5.1 醫學方面 19
2.3.5.2 食品方面 22
2.3.5.3 其它方面 23
2.4 植物生長促進劑--生物技術於有機肥料的應用 23
2.4.1 有機肥料之種類 24
2.4.2 有機肥料的配製 25
2.4.3 有機質肥料之發展 25
2.4.4 有機堆肥製作的重要性 26
2.4.5 有機廢棄物直接施用之弊端 27
第三章 材料與方法 28
3.1 實驗材料 28
3.1.1 菌株來源 28
3.1.2 培養基材料 28
3.1.3 化學材料 28
3.1.4 膠體材料 29
3.1.5 實驗器材 30
3.2 實驗方法 31
3.2.1 蛋白酶生產菌之活化與保存 31
3.2.1.1 材料來源 31
3.2.1.2 菌株之活化及保存 31
3.2.2 蛋白酶生產條件之探討 33
3.2.2.1 蛋白酶活性之測定 33
3.2.2.2 最適發酵條件之探討 33
3.2.2.2.1 最適培養時間的測定 33
3.2.2.2.2 最適培養溫度的測定 34
3.2.2.2.3 最適培養體積的探討 34
3.2.2.2.4 主要碳源蝦蟹殼粉含量之測定 34
3.2.2.2.5 最適氮源種類的測定 34
3.2.2.2.6 最適氮源濃度的測定 35
3.2.2.2.7 初始培養基酸鹼值的測定 35
3.2.2.2.8 蛋白酶儲藏時間之影響 35
3.2.3 蛋白酶之分離純化 36
3.2.3.1 大量培養 36
3.2.3.2 硫酸銨沈澱及透析 36
3.2.3.3 離子交換樹脂層析法 37
3.2.3.4 分子量標定與膠體過濾層析法 37
3.2.3.5 蛋白質濃度測定 38
3.2.4 蛋白酶之生化性質探討 38
3.2.4.1 電泳分析 38
3.2.4.2 等電點之測定 40
3.2.4.3 作用最適溫度的測定 40
3.2.4.4 蛋白酶於100℃之熱穩定性探討 40
3.2.4.5 酵素作用最適pH的測定 41
3.2.4.6 酵素pH安定性的測定 41
3.2.4.7 蛋白酶抑制劑的測定 42
3.2.5 Monascus purpureus CCRC31499發酵蝦蟹廢棄物生產
蛋白酶之應用 43
3.2.5.1 利用Monascus purpureus CCRC31499發酵各種蝦蟹廢棄物
生產蛋白酶 43
3.2.5.1.1 蝦蟹殼之前處理 43
3.2.5.1.2 酵素液之製備 45
3.2.5.1.3 以不同方式處理蝦蟹殼粉為碳源對蛋白酶生產的影響 45
3.2.5.2 植物生長促進劑之田間試驗 45
3.2.5.2.1 植物生長促進劑之製備 45
3.2.5.2.2 小白菜及莧菜芽苗之預培養 46
3.2.5.2.3 小白菜及莧菜之栽培 46
第四章 結果與討論 48
4.1 Monascus purpureus CCRC31499所生產蛋白酶最適培養條件探討48
4.1.1 培養時間 48
4.1.2 培養溫度 48
4.1.3 培養體積 49
4.1.4 主要碳源蝦蟹殼粉之含量 49
4.1.5 不同濃度poly-peptone對蛋白酶生產之影響 49
4.1.6 不同濃度yeast extract對蛋白酶生產之影響 49
4.1.7 初始培養基酸鹼值 50
4.1.8 蛋白酶儲藏時間之影響 50
4.1.9 綜合結果 51
4.2 Monascus purpureus CCRC31499所生產蛋白酶之分離純化 60
4.2.1 粗酵素液之製備 60
4.2.2 離子交換管柱層析法 60
4.2.3 膠體過濾層析法 61
4.2.4 蛋白質濃度測定 61
4.2.5 酵素之純化概要表 62
4.3 Monascus purpureus CCRC31499所生產蛋白酶之生化性質分析 68
4.3.1 酵素之分子量判定 68
4.3.2 酵素之等電點 68
4.3.3 酵素之最適反應溫度測定 69
4.3.4 蛋白酶於100℃之熱穩定性 69
4.3.5 酵素之最適反應pH值測定 69
4.3.6 酵素之pH安定性 70
4.3.7 蛋白酶抑制劑 70
4.4 Monascus purpureus CCRC31499發酵蝦蟹廢棄物生產蛋白酶之應用 80
4.4.1 以不同方式處理SCSP為碳源對蛋白酶生產的影響 80
4.4.2 植物生長促進劑之田間試驗 87
第五章 結論 90
參考文獻 92
圖目錄
圖3.1 實驗設計流程圖 47
圖4.1 不同培養時間對蛋白酶生產之影響 52
圖4.2 不同培養溫度對蛋白酶生產之影響 53
圖4.3 不同培養體積對蛋白酶 生產之影響 54
圖4.4 不同SCSP含量對蛋白酶生產之影響 55
圖4.5 不同濃度poly-peptone對蛋白酶生產之影響 56
圖4.6 不同濃度yeast extract對蛋白酶生產之影響 57
圖4.7 不同pH值對蛋白酶生產之影響 58
圖4.8 M. purpureus CCRC31499 蛋白酶儲藏時間之影響 59
圖4.9 M. purpureus CCRC31499所生產蛋白酶之分離純化流程圖 63
圖4.10 DEAD Sepharose CL-6B之蛋白酶層析圖譜 64
圖4.11 Sephacryl S-200之蛋白酶層析圖譜 65
圖4.12 BSA之標準檢量線 66
圖4.13 12% 之SDS-PAGE檢測酵素純化效果 71
圖4.14 酵素之等電點層析圖譜 72
圖4.15 酵素之最適反應溫度 73
圖4.16 M. purpureus CCRC31499 所生產蛋白酶於100℃之熱
穩定性探討 74
圖4.17 酵素之最適反應PH 75
圖4.18 酵素之 PH安定性 76
圖4.19 分別以2% 不同處理方式的SCSP為碳源，其蛋白酶產量之比較82
圖4.20 分別以2% 不同處理方式SCSP的上清液為碳源，在
不同天數下之蛋白酶產量之比較 83
圖4.21 分別以不同濃度且不同處理方式SCSP的為碳源，
其蛋白酶產量之比較 84
圖4.22 分別以不同濃度且不同處理方式的SCSP上清液為碳
源，其蛋白酶產量之比較 85
表目錄
表2.1 水產加工廢棄物資源化之實施例 9
表2.2 列出一些工業上常見蛋白酶及一些特性 15
表2.3 一些工業上重要的鹼性蛋白酶 20
表2.4 各種蛋白酶在醫學上之治療概況 21
表3.1 紅麴菌株最適培養條件一覽表 32
表3.2 蛋白質標準品組成之分子量 39
表4.1 M. purpureus CCRC31499所生產蛋白酶之純化表 67
表4.2 數種蛋白酶抑制劑對於M. purpureus CCRC31499蛋白
酶活性的影響 77
表4.3 本研究酵素與其他蛋白酶的生化活性之比較 78
表4.4 M. purpureus CCRC31499以7種處理的蝦蟹殼粉為碳
源生產蛋白酶的最適條件整理 86
表4.5 植物生長促進劑對小白菜生長之重量及長度的影響 88
表 4.6 植物生長促進劑對莧菜生長之重量及長度的影響 89

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