臺灣博碩士論文加值系統

本研究主要目的是以溫度敏感型載體-奈米微脂體( TL)，利用薄膜水合法製備出可包覆藥物的奈米磁性載體 – 磁性微脂體(Magnetic liposome, TML)，利用pH梯度法包覆抗癌藥物愛萊諾迪肯(Irinotecan, CPT-11)即TML@CPT-11，再接上具有癌細胞表皮生長因子受體辨識能力的單株抗體 (cetuximab, CET)即TML@CPT11-CET，最後藉由動物模式探討兼具有緩釋及標靶性的癌症治療之功效。
我們將製備出來的 TML@CPT11-CET 透過 DLS、DSC、TEM、XRD、FTIR、Zeta potential、TGA、SQUID 及ICP分析其物理與化學性質。接著由藥物吸附及釋放的實驗結果得到 TML@CPT11-CET可包覆72.51% 的 CPT-11，利用溫感微脂體本身的溫度敏感釋放特性，於43℃ 的環境下30分鐘後的藥物釋放量是在37℃時的將近兩倍；利用AMF可達到藥物控制釋放，無磁場作用下30分鐘釋放量為20%，而在有磁場的情況下15分鐘釋放量已達100%是無磁場的5倍量。
體外細胞實驗的部份，我們將磁性載體以螢光染劑(5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide NHS) 修飾後觀察癌細胞吞噬磁性載體的情形，結果顯示 TML-CET 被癌細胞吞噬的量大於 TML ，證實加入 CET 是有助於增加磁性載體被癌細胞吞噬的機會。透過癌細胞存活率的實驗證實此標靶性給藥方式可更有效增加 CPT-11 對癌細胞的毒殺效果。由於在37℃時藥物未完全釋放，故 TML@CPT11-CET 的 IC50 和 TML@CPT11 的 IC50，皆比 feee CPT-11 的 IC50 為高，但前者由於標靶作用IC50 較後者低，進一步利用微脂體本身溫度敏感的特性，於 TML@CPT11-CET 給藥，再放入43℃的環境下30分鐘後，細胞存活率較37℃還來得低，表示藥物釋放量較37℃環境下多。此外藉由在磁鐵影響下的癌細胞存活實驗，亦證實磁性載體能以磁導的方式局部毒殺磁場作用部位之癌細胞，並以西方墨點法以及流式細胞儀證實接枝CET後之奈米磁性載體TML@CPT11-CET，能以CPT-11的作用促使細胞凋亡，且大量表現細胞凋亡途徑中的蛋白質。最後，體內動物實驗的部分，透過非侵入性活體分子影像分析(IVIS)及磁振造影(MRI)觀察經藥物治療的癌細胞活性，經21天的影像評估可以明顯觀察到相較其他組別之藥物載體，TML@CPT11-CET+magnetic+AMF 可有效的釋放藥物以達到抑制癌細胞的生長。

Cetuximab (CET) conjugated thermo-sensitive magnetic liposome (TML) was prepared for targeted delivery of Irinotecan (CPT-11). Dual targeting effects could be achieved by co-encapsulating iron oxide nanoparticles with CPT-11 in the liposome (magnetic targeting) and conjugating the epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody CET on liposome surface for recognition by EGFR overexpressed on glioma cell surface (ligand targeting). TML@CPT11-CET was characterized by DLS, DSC, TEM, XRD, FTIR, zeta potential, TGA, SQUID and ICP for physico-chemical properties.
The drug encapsulation efficiency in TML@CPT11-CET could reach 72.5%. Thermosensitive drug release was demonstrated at 43 oC and 37 oC and in an alternating magnetic field (AMF) due to hyperthermia effects of iron oxide nanoparticles. Total drug release was achieved in an AMF within 15 min compared with 20% release in 30 min without an AMF. In vitro cell culture studies with U87 human glioblastoma cells indicates enhanced cellular uptake of fluorescence- labelled TML-CET through interactions of highly expressed EGFR on cell surface with CET.
Decreased IC50 (half drug concentration of cell death) for TML@CPT11-CET compared with TML@CPT11 showed the enhanced cytotoxicity toward U87 at 37 oC after conjugating TML with CET. The cell cytotoxicity could be enhanced by raising temperature to 43 oC due to the thermos-sensitive nature of drug release. The molecular mechanism of U87 cell death with TML@CPT11-CET was confirmed to be cell apoptosis induced by CPT-11 from Western blot and flow cytometry analysis.
In vivo brain tumor animal models in nude mice using U87 cells carrying luciferase gene demonstrated the lowest BLI ratio and smallest tumor size by IVIS at day 21 when TML@CPT11-CET was administrated through IV injection followed by magnetic targeting and AMF treatment when compared with no-treatment and free CPT-11 groups at the same drug dosage. The substantial shrinkage in tumor size could also be demonstrated through magnetic resonance imaging (MRI).

指導教授推薦書
口試委員會審定書
致謝 iii
縮寫表 iv
中文摘要 vi
Abstract viii
總目錄 x
表目錄 xv
圖目錄 xvi
第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 研究動機與目的 2
第二章 文獻回顧 4
2.1 奈米科技於藥物傳遞系統之應用 4
2.1.1 標靶治療 7
2.1.2 藥物控制釋放系統 9
2.2 Irinotecan 11
2.2.1 Irinotecan的發展史 11
2.2.2 Irinotecan的結構與作用機制 13
2.3 微脂體 16
2.3.1 微脂體簡介 16
2.3.2 微脂體構造 17
2.3.3 微脂體的組成 18
2.3.4 微脂體分類 19
2.3.5 以微脂體當作藥物載體 21
2.3.6 微脂體製備方法 25
2.3.7 微脂體的相行為 29
2.3.8 pH gradient與微脂體的包覆 30
2.3.9 微脂體包覆Irinotecan的探討 32
2.4 磁性奈米粒子 33
2.4.1 磁性奈米粒子之合成 34
2.4.2 磁性奈米粒子之特性 35
2.5 西妥昔單抗(cetuximab, CET) 38
第三章 實驗藥品與方法 41
3.1 實驗藥品 41
3.2 實驗設備 43
3.3 實驗架構 47
3.4 實驗方法 48
3.4.1 材料製備 48
3.4.1.1 製備檸檬酸修飾四氧化三鐵磁性粒子 48
3.4.1.2 製備磁性奈米藥物微脂體 (Magnetic liposome) 49
3.4.1.3配位體以共價鍵修飾磁性奈米粒子 50
3.4.1.4 蛋白質定量分析 51
3.4.1.5 螢光奈米載體合成 52
3.4.2 藥物傳遞研究 53
3.4.2.1 藥物包覆量測定 53
3.4.2.2 利用不同溫度進行體外藥物釋放測定 55
3.4.2.3利用(Alternating magnetic field,AFM)進行體外藥物釋放 55
3.4.3 奈米載體之物化性分析 56
3.4.3.1 動態光散射分析 (DLS) 56
3.4.3.2 穿透式電子顯微鏡 (TEM) 56
3.4.3.3 介面電位分析 (Zeta potential) 57
3.4.3.4 傅立葉轉換紅外線光譜儀分析 (FTIR) 58
3.4.3.5 X光繞射分析儀 (XRD) 58
3.4.3.6 熱重量分析 (TGA) 59
3.4.3.7 感應耦合電漿放射光譜儀 (ICP-OES) 59
3.4.3.8 微差掃描熱卡計(Different Scanning Calorimetry, DSC) 60
3.4.3.9超導量子干涉磁化儀分析 (SQUID) 60
3.4.4 體外細胞實驗 60
3.4.4.1 細胞吞噬作用的影響 60
3.4.4.2 生物相容性實驗 62
3.4.4.3 磁性載體之細胞毒性測定 63
3.4.4.4 細胞存活率分析(MTS assay) 64
3.4.4.5磁性載體於細胞內作用 65
3.4.4.6組織蛋白質萃取與定量 66
3.4.4.7西方墨點法 (Western blot) 67
3.4.4.8奈米藥物對細胞凋亡現象( Apoptotic measurement) 69
3.4.5體外溶血試驗 (Hemolysis assay) 70
3.4.6體內動物實驗 70
3.4.6.1 裸鼠腫瘤之建立 70
3.4.6.2 動物體內抗腫瘤試驗 71
3.4.6.3 活體冷光影像系統( In Vivo Imaging System, IVIS) 73
3.4.6.4 核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI) 73
第四章 結果與討論 75
4.1 磁性載體之製備 75
4.1.1蛋白質定量分析 76
4.2藥物包覆及釋放測試 77
4.2.1 藥物包覆量測定 77
4.2.2奈米載體體外藥物釋放 80
4.2.3奈米載體體外磁導控制釋放 81
4.3微脂體之物化性分析 82
4.3.1動態光散射分析(DLS) 82
4.3.2穿透式電子顯微鏡分析(TEM) 84
4.3.3表面電位分析(Zeta potential) 86
4.3.4 X 光繞射儀分析 (XRD) 87
4.3.5傅立葉轉換紅外線光譜儀分析 (FT-IR) 89
4.3.6熱重分析儀 (TGA) 91
4.3.7感應耦合電漿放射光譜儀分析 (ICP-OES) 93
4.3.8微差掃描熱卡計(DSC) 94
4.3.9超導量子干涉磁化儀分析 (SQUID) 95
4.4 磁性載體之體外實驗 98
4.4.1 細胞吞噬作用的影響 98
4.4.2 生物相容性 101
4.4.3 細胞毒殺測試 102
4.4.4磁場作用對細胞毒殺測試 107
4.4.5 膠質母細胞瘤的蛋白表現量 109
4.4.6 細胞凋亡 113
4.5 體外溶血實驗(Hemolysis assay) 116
4.6 體內動物實驗 119
4.6.1非侵入式活體分子影像分析 (IVIS) 119
4.6.2核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI) 121
第五章 結論 124
參考文獻 126
 
表目錄
表4-1 藥物載負量參數表 (CMNP=0.05mg)。 78
表4-2 藥物載負量參數表 (CPT-11=1mg)。 79
表4-3材料粒徑分佈與分散度 83
表4-4各種載體之表面電位。 87
表4-5 各磁性樣品之弧度與粒徑。 89
表4-6 各種載體之官能基。 91
表4-7 不同磁性載體之TGA和ICP含量比較。 94
表4-8 DPPC與微脂體之相轉變特性 。 95
表4-9 SQUID 分析之飽和磁化強度和殘存磁化強度。 97
表4-10 各藥物載體在37℃之IC50。 104
表4-11 細胞受不同藥物載體測試之細胞凋亡比例。 116

圖目錄
圖1-1 實驗示意圖 3
圖2-1 奈米粒子的多重應用 6
圖2-2 應用於藥物釋放系統的奈米材料 6
圖2-3 主動標靶示意圖 8
圖2-4 藉由EPR效應的被動標靶示意圖 9
圖2-5 傳統藥物傳遞和控制釋放的釋放模式比較圖 11
圖2-6 Irinotecan的結構式 13
圖2-7 Irinotecan pathway 15
圖2-8 脂雙層結構 18
圖2-9 微脂體的分類 21
圖2-10 藥物載體到達腫瘤細胞藥物釋放需經過層層關卡 22
圖2-11 微脂體表面加上PEG修飾可保護微脂體免於被RES系統辨認清楚 23
圖2-12 刺激藥物釋放分類 25
圖2-13 脂雙層膜在經過相轉移溫度時結構改變的示意圖 30
圖2-14 pH gradient造成藥物由膜的外側擴散至內側 31
圖2-15 Irinotecan水解形成SN-38 33
圖2-16 藉由外加磁場將磁性載體(Magnetic Targeted Carriers, MTC)引導至病變部位的示意圖 34
圖2-17 以化學共沉澱法製備磁性粒子示意圖 35
圖2-18 鐵磁性物質之磁滯曲線示意圖 36
圖2-19 順磁性物質的磁滯曲線示意圖 37
圖2-20 保護劑對飽和磁化率的影響 38
圖2-21 Cetuximab對於EGFR之作用模式 40
圖3-1 實驗架構 47
圖3-2 CET修飾磁性奈米粒子 51
圖3-3 Cetuximab之檢量線 52
圖3-4 Irinotecan的檢量線圖 54
圖3-5細胞培養之磁場引導示意圖 66
圖3-6 動物磁導示意圖 72
圖3-7 動物磁場加熱示意圖 72
圖4-1 奈米載體於不同時間點在PBS buffer之柱狀圖 76
圖4-2 TML 和CPT-11 (0.5、1、1.5、2及2.5 mg，於1 mL pH=7.4 之PB) 之負載率及包覆率之關係圖 79
圖4-3 TML@CPT-11 和CMNP (0.05、0.1、0.15、0.2及0.4 mg，於1 mL pH=7.4 之PB) 之負載率及包覆率之關係圖 80
圖4-4 TML@CPT-11-CET (5 mg/mL)於不同時間及不同溫度下之累積釋放百分比 81
圖4-5 TML@CPT-11-CET (5 mg/mL)於不同時間及AMF下之累積釋放百分比 82
圖4-6 不同種類樣品之粒徑分布圖 84
圖4-7 不同種類樣品之穿透式電子顯微鏡分析圖 85
圖4-8 XRD 分析圖譜 88
圖4-9 FT-IR 分析圖譜 90
圖4-10 Fe3O4之TGA 分析圖 92
圖4-11 磁性載體之TGA 分析圖 93
圖4-12 DPPC與TML的微差掃描熱分析圖 95
圖4-13 不同磁性載體之SQUID分析圖 97
圖4-14磁性載體對細胞吞噬的影響 101
圖4-15 在 3T3 細胞貼附 24 小時後，TML於0.001, 0.01,0.1,1, 10, 100, 1000 mg/ml 的濃度下作用 24 小時後之細胞存活率 102
圖4-16 在 U87 細胞貼附 24 小時後，TML於0.001, 0.01,0.1,1, 10, 100, 1000 mg/ml 的濃度下作用 24 小時後之細胞存活率 103
圖4-17 在 U87 細胞貼附 24 小時後，比較不同磁性載體於0.001, 0.01,0.1,1, 10, 100 mg/ml 的濃度下作用 72 小時後之細胞存活率 104
圖4-18 在 U87 細胞貼附 24 小時後，在不同溫度下比較不同磁性載體於10 mg/ml 的濃度下作用 72 小時後之細胞存活率 105
圖4-19在 U87 細胞貼附 24 小時後，在AMF作用下比較不同磁性載體於10 mg/ml 的濃度之細胞存活率 107
圖4-20 U87 細胞貼附 24 小時並與藥物載體作用 72 小時後之(a)藉由外加磁場將藥物載體引導至局部顯示圖；(b) 螢光顯微鏡圖 109
圖4-21 U87 細胞中ERK蛋白表現量在不同磁性載體以Western blot測試之結果 110
圖4-22 ERK於U87 cell中的蛋白定量表現結果 111
圖4-23 U87 細胞中pERK蛋白表現量在不同磁性載體以Western blot測試之結果 111
圖4-24 pERK於U87 cell中的蛋白定量表現結果 112
圖4-25 U87 細胞中Caspase 3蛋白表現量在不同磁性載體以Western blot測試之結果 112
圖4-26 Caspase 3於U87 cell中的蛋白定量表現結果 113
圖4-27 細胞貼附24小時並與藥物載體作用72小時後之細胞凋亡現象圖 116
圖4-28 不同濃度的TML 之溶血實驗結果 117
圖4-29 不同濃度的TML 之溶血實驗結果(柱狀圖) 118
圖4-30 TML 與紅血球作用後，離心完後結果 118
圖4-31 IVIS結果圖 120
圖4-32 BLI定量結果 121
圖4-33 MRI影像圖 123

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