臺灣博碩士論文加值系統

磷酸化蛋白質是蛋白質體學上一個很重要的後轉譯修飾(posttranslational odifications)，可藉由質譜來偵測到我們所需要的資訊。一般來說在質譜上的離子化效應會抑制所偵測到的訊號強度，所以使用與生物親和性的粒子來萃取磷酸化胜肽用在質譜上的分析是很重要的前處理。
本篇論文利用磁性奈米碳包鐵(Fe@C)當作基材固定幾丁聚醣來進行親和性來萃取純化磷酸化胜肽，運用在質譜分析。為了證明用磁性奈米粒子結合幾丁聚醣去做磷酸化胜肽萃取純化這個方法的可行性，我們利用消化過後的β-酪蛋白和BSA牛血清蛋白兩者混和後的蛋白質和消化後牛奶的蛋白質再經由粒子萃取，此方法對磷酸化胜肽有很高的專一性，在萃取已經過消化過後的蛋白質(Protein)，用含有磷酸的胜肽(β-酪蛋白)與非磷酸胜肽牛血清蛋白(BSA)，其比例達到1:1000，之後會純化出只有磷酸根的胜肽。我們還選用消化後低脂牛奶增加樣品的複雜度，結果可以鑑定出牛奶裡的磷酸化蛋白質，由此證明這方法對磷酸化蛋白質的選擇性是非常的不錯。
此奈米碳包鐵粒子結合幾丁聚醣的構想提供了簡單、有效、快速萃取的方法用來分離磷酸胜肽之後進入MALDI-TOF MS去做分析，並能原始的物質中得到的許多訊息。

A facile and effective approach to synthesize chitosan-immobilized magnetic nanoparticles was proposed using carbon-encapsulated iron nanoparticles (Fe@CNPs) as the magnetic core.Poly(acrylic acid)-coated Fe@CNPs were prepared by free radical polymerization of acrylic acid and used as magnetic substrates for subsequent Chitosan immobilization.The chitosan-immobilized magnetic probes were applied for rapid and selective identification of phosphopeptides from complex peptide mixtures by MALDI-TOF MS.

目錄
壹、緒論……………………………………………………………………………………1
1.1蛋白質中的磷酸化………………………………………………………..……………1
1.2 親和性萃取磷酸化蛋白和磷酸化胜肽………………….……………………………3
1.3幾丁聚醣的簡介………………………………………………………………..………5
1.4 幾丁聚醣物理與化學性質溶解性質………………………….………………………6
1.5 幾丁聚醣和蛋白質的影響……………………………………….……………………7
1.6 磁性奈米粒子的簡介………………………………………………….………………7
1.7 磁性奈米粒子……………………………………………………………….…………8
1.8 奈米碳包鐵粒子的特性………………………………………….……………………8
1.9 功能性奈米碳包鐵發展與應用………………………….……………………………9
1.10 奈米碳包鐵在生化方面的應用……………………….…………………..…………9
1.11 質譜法…………………………………………………………….…………………10
1.12 利用質譜分析磷酸化蛋白質所遇到的問題………………………….……………12
1.13 MALDI 的基本原理…………………………………………………………...……13
1.14 MALDI-MS的特點………………………………………….………………………13
1.15 MALDI-MS 在生化分析之應用……………………………………………………14
貳、論文目標……………………………………………………………………..………15
参、實驗步驟………………………………………………………..……………………16
3.1儀器裝置………………………………………………………….……………………16
3.2實驗藥品………………………………………………………………………………17
3.3聚丙烯酸@奈米碳包鐵的製備 ……………………..………………………………18
3.4 Fe@PAA/Chitosan Nanospheres修飾的步驟…………………...……………………19
3.5蛋白質的消化步驟……………………………………………………………………19
3.6 分析環境複雜度對濃縮萃取的影響…………………………...……………………20
3.7 最佳化Incubation的測試………………………………………………..……………21
3.8 在不同乙腈濃度條件下濃縮萃取………………………………...…………………22
3.9 在不同酸度條件下濃縮萃取……………………………………...…………………22
3.10 不同沖提時間下的比較…………………………………………….………………23
3.11 DHB溶液的配置……………………………………………………………….……24
3.12 Fe@C-PAA-Chitosan吸附量的實驗 …………………………….....………………24
3.13 低脂牛奶的消化步驟 …………………………………………………...…………25
3.14牛奶磷酸化蛋白質濃縮萃取的步驟…………………………………….….………25
肆、結果與討論…………………………………………………………………..….…….27
4.1聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵表面電位的結果討論.................27
4.2聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵的粒徑分布.................................28
4.3用SEM 觀察聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵的大小與表面結構..........................................................................................................................................29
4.4聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵的熱重分析.................................30
4.5 奈米碳包鐵、聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵測試......................31
4.6 Incubation最佳化時間...................................................................................................32
4.7 修飾聚丙烯酸@奈米碳包鐵來濃縮萃取已酵素消化混合的討論...........................32
4.8 溶液極性的影響（改變ACN 濃度）.............................................................................34
4.9 溶液酸度的影響（改變TFA 濃度）.............................................................................35
4.10 消化過後的β-casein的偵測極限討論........................................................................37
4.11 幾丁聚醣@奈米碳包鐵吸附量.................................................................................38
4.12 高複雜環境對磁性奈米粒子萃取濃縮效果的影響.................................................39
4.13連續親和層析技術萃取牛奶中的蛋白質磷酸化結果討論......................................40
4.14 沖提時間對沖提試劑之沖提效果討論.....................................................................42
伍、結論..............................................................................................................................43
陸、未來與展望..................................................................................................................44
柒、參考資料......................................................................................................................45





圖、表目錄
第一章
圖1.蛋白質可逆磷酸化的示意圖........................................................................................2
圖2.磷酸化不同方式的濃縮萃取........................................................................................3
圖3.幾丁質和幾丁聚醣的結構.............................................................................................6
圖4.磁性奈米粒子與幾丁聚醣的靜電引力示意圖............................................................7
圖5.質譜分析蛋白質的方法...............................................................................................11
第三章
圖3.1-1基質輔助雷射脫附-時間飛行質譜儀....................................................................16
圖3.1-2奈米粒徑分析儀......................................................................................................17
圖3.2-1碳包鐵粒子修飾聚丙烯酸示意圖.........................................................................19
圖3.2-2幾丁聚醣修飾在碳包鐵粒子合成圖.....................................................................19
圖3.3 Chitosan-coated Fe@C 濃縮萃取磷酸化胜肽流程圖.............................................21
第四章
圖4.1 兩份粒子的zeta potential 對溶劑不同的pH經由奈米粒徑及表面電位分析儀所測量的圖譜。圖中□的曲線為幾丁聚醣@奈米碳包鐵；而○的曲線為聚丙烯酸@奈米碳包鐵粒子。............................................................................................................................28
圖4.2兩條曲線分別為粒子去做奈米粒徑及表面電位分析儀所測得的粒徑。綠色為幾丁聚醣@奈米碳包鐵；藍色為聚丙烯酸@奈米碳包鐵粒子。...........................................29
圖4.3為聚丙烯酸@奈米碳包鐵與幾丁聚醣@奈米碳包鐵在SEM不同倍率下所顯示的表面(a) 聚丙烯酸@奈米碳包鐵放大500倍(b) 聚丙烯酸@奈米碳包鐵放大3500倍(c) 幾丁聚醣@奈米碳包鐵放大500倍(d) 幾丁聚醣@奈米碳包鐵放大3500倍..........................................................................................................................................30
圖4.4兩條曲線分別兩種粒子去做熱重分析(TGA)分析實驗。綠色為幾丁聚醣@奈米碳包鐵；藍色為聚丙烯酸@奈米碳包鐵粒子..................................................................31
圖4.5 (a)奈米碳包鐵(b)聚丙烯酸@奈米碳包鐵(c)幾丁聚醣@奈米碳包鐵用強力磁鐵做分離所得到的圖..............................................................................................................31
圖4.6 用酵素消化過後的β-casein(1 pmol，1µL)在不同的反應時間進行MALDI-TOF MS分析所得到的圖譜(a)30 s(b)1 min(c)5 min(d)10 min(e)15 min..................................32
圖4.7 (a)1 pmol α-casein和β-caseincc混合後直接以MALDI-MS分析(b)聚丙烯酸@奈米碳包鐵(c)幾丁聚醣@奈米碳包鐵......................................................................................34
圖4.8 利用 MALDI-MS 分析，磁性奈米粒子在不同濃度 ACN 比例環境下萃取
1：100莫爾比例之消化後β-casein與BSA的磷酸化胜肽的質譜圖：（a）20 %
ACN；（b）40 % ACN；（c）60 % ACN；（d）80 % ACN。* 星號代表磷酸化
胜肽位置。..........................................................................................................................35
圖4.9 利用 MALDI-MS 分析，磁性奈米粒子在不同濃度 TFA 比例環境下萃取
1：100 莫爾比例之消化後β-casein 與 BSA 的磷酸化胜肽的質譜圖：（a）10 % TFA；
（b）1 % TFA；（c）0.1 % TFA；（d）0.01 % TFA。星號代表磷酸化胜肽位置。........................................................................................................................................36
圖4.10 利用 MALDI-TOF MS 分析，磁性奈米探針在40 % ACN, 1 % TFA 環境下萃取不同莫爾數之消化後β-casein 的磷酸化胜肽的質譜圖： （a）10 pmol；（b）
1 pmol；（c）500 fmol；（d）100 fmol。星號代表磷酸化胜肽位置。......................................37
圖4.11 利用幾丁聚醣@奈米碳包鐵(20 μg)去做不同濃度的β-casein做吸附量的實驗■為40 pmol的β-casein ●為30 pmol的β-casein ▲為20 pmol的β-casein.........................39
圖4.12 BSA的胜肽的質譜圖（a-c）利用 MALDI-MS 分析，磁性奈米粒子在不同莫爾比例之消化後β-casein 與 BSA 的磷酸化胜肽的質譜圖：（a）1：100未經粒子萃取；（b）1：100；（c）1：500；(d)1:1000。星號代表磷酸化胜肽位置。………………………40
圖4.13 利用磁性奈米粒子來濃縮萃取消化過的牛奶中的α、β-casein，(a)是牛奶未經粒子萃取的質譜圖(b)經由粒子萃取後經由MALDI-TOF MS分析所鑑定出來的磷酸化胜肽訊號質譜圖，*為磷酸化位置。…................................................................................41
圖4.14 利用 MALDI-MS 分析，磁性奈米粒子在40 % ACN, 1 % TFA 比例環境下萃取1 pmol 消化後β-casein 的磷酸化胜肽，再不同時間下用含有 12.5 % NH4OH 沖提劑從粒子上所沖提下來之萃取物的質譜圖：（a）15 min；（b）30 min；（c）60 min 。………………………………………………………………………..…………..…42
表1 利用磁性奈米粒子來濃縮萃取消化過的牛奶中的α、β-casein，去經由MALDI-TOF MS分析所鑑定出來的磷酸化胜肽訊號。…………………………………..………..…..41

(1) Lehninger, A.; Nelson, D.; Cox, M. Principles of biochemistry; Worth Publishers New York, 2009.
(2) Gu, W.; Shi, X.-L.; Roeder, R. G. Nature 1997, 387, 819-823.
(3) Holmberg, C. I.; Tran, S. E. F.; Eriksson, J. E.; Sistonen, L.,Trends in Biochemical Sciences 2002, 27 (12), 619-627.
(4) Arif, A.; Jia, J.; Mukhopadhyay, R.; Willard, B.; Kinter, M.; Fox, P. L. Molecular Cell 2009, 35, 164-180.
(5) Thingholm, T. E.; Jensen, O. N.; Larsen, M. R., Proteomics 2009, 9 (6), 1451-1468.
(6) McLachlin, D. T.; Chait, B. T. Analytical Chemistry 2003, 75, 6826-6836.
(7) Molloy, M. P.; Andrews, P. C. Analytical Chemistry 2001, 73, 5387-5394.
(8) Ishihama, Y.; Sato, T.; Tabata, T.; Miyamoto, N.; Sagane, K.; Nagasu, T.; Oda, Y.Nat Biotech 2005, 23, 617-621.
(9) Tao, W. A.; Wollscheid, B.; O'Brien, R.; Eng, J. K.; Li, X. J.; Bodenmiller, B.; Watts, J. D.; Hood, L.; Aebersold, R.,Nature Methods 2005, 2 (8), 591-598.
(10) Porath, J.; Carlsson, J. A. N.; Olsson, I.; Belfrage, G. Nature 1975, 258, 598-599.
(11) T.W.Hutchens；T.T.Yip, J.Chrmatogr.1992, 604,133.
(12) R.R. Begum; R.J. Newbold; D. Whitford, J. Chromatogr. B 2000, 737, 199.
(13) Arnold, F. H. Nat Biotech 1991, 9, 151-156.
(14) Wong, J. W.; Albright, R. L.; Wang, N.-H. L. Separation and purification methods1991, 20, 49-106.
(15) Posewitz, M. C.; Tempst, P.,Analytical Chemistry 1999, 71 (14), 2883-2892.
(16) Ndassa, Y. M.; Orsi, C.; Marto, J. A.; Chen, S.; Ross, M. M. Journal of Proteome Research 2006, 5, 2789-2799.
(17) Caruso, F.; Mohwald, H. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6039–6046.
(18) Cooper, C. L.; Dubin, P. L.; Kayitmazer, A. B.; Turksen, S. Curr.
Opin. Colloid Interface Sci. 2005, 10, 52–78.
(19) de Kruif, C. G.; Weinbreck, F.; de Vries, R. Curr. Opin. Colloid
Interface Sci. 2004, 9, 340–349.
(20) Hamidi, M.; Azadi, A.; Rafiei, P. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008,60, 1638–1649.
(21) Burgess, D. J.; Dubin, P. L.; Bock, J.; Davies, R. M.; Schulz, D. N.;
Thies, C. Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology; Springer-Verlag: Berlin, 1994.
(22) Chan, C.; Burrows, L. L.; Deber, C. M. J. Biol. Chem. 2004,279, 38749–38754.
(23) Kuo, H. H.; Chan, C.; Burrows, L. L.; Deber, C. M. Chem. Biol.Drug Des. 2007, 69, 405–412.
(24) Shoichet, M. S. Macromolecules 2010, 43, 581–591.
(25) Kuschert, G. S. V.; Coulin, F.; Power, C. A.; Proudfoot, A. E. I.;Hubbard, R. E.; Hoogewerf, A. J.; Wells, T. N. C. Biochemistry 1999,38, 12959–12968.
(26) Rusnati, M.; Coltrini, D.; Oreste, P.; Zoppetti, G.; Albini, A.;
Noonan, D.; Faagagna, F. A.; Giacca, M.; Prestai, M. J. Biol. Chem. 1997,
272, 11313–11320.
(27)牟中原、陳家俊,「奈米材料研究發展」,科學發展,2000年,第28卷,281-288 頁
(28) B.I.Haukanes,C.Kvam,Bio/Technology,1993,11,60-63.
(29)張勳高,江明,劉英,等.交流碳弧法合成碳包鐵奈米晶體[J].高等化學學
(30) 趙寶剛,林耀強,劉存業,等.電弧法製備Fe-C奈米微粒的分析[J].化學物理學 報,1999,80(1),103-108.
(31) Henry,John.;Scotta J,Krishna,J Appl phys,1999,85(8),4409-4411.
(32) Jun JIAO,Sunpapan Seraphin,Xikun Wang,J Appl phys,1996,80(1),103-108.
(33) Haiyan Zhang,Journal of Materials Science Letters,1999,18,919-920.
(34) Hsin,Y.L.;J.Y.;Hwang,K.C.;Lo,S.C.;Chen,F.R.;Kai,J.J.,Carbon,2006,44,3328-3335.
(35) Liang,Y.C;Hwang,K.C.;LO,S.C,Small,2008,4,NO.4,405-409.
(36) Pankhurst,Q.A.;Connolly,J.;Jones,S.K.;Dobson,J.Phys.D.Appl.Phys.2003,36,167-181.
(37) Dresco,P.A.;Zaitsev,V.S.;Gambino,R.J.;Chu,B.,Langmuir 1999,15,1945-1951.
(38)Pankhurst,Q.A.;Connolly,J.;Jones,S.K.;Dobson,J.,J.Phys.D:Appl.Phys.2003,36,167-14.
(39) Fenn, J.; Mann, M.; Meng, C.; Wong, S.; Whitehouse, C. Science 1989, 246, 64-71.
(40) Hillenkamp, F.; Karas, M. In Methods in Enzymology; James, A. M., Ed.; Academic Press: 1990; Vol. 193, p 280.
(41) Annan, R. S.; Carr, S. A. Analytical Chemistry 1996, 68, 3413-3421
(42) Gafken, P. R.; Lampe, P. D., Cell Communication and Adhesion 2006, 13 (5-6), 249-262.
(43) Yates, J. R.; Ruse, C. I.; Nakorchevsky, A.,Annual Review of Biomedical Engineering 2009, 11, 49-79.
(44) Dunn, J. D.; Reid, G. E.; Bruening, M. L. Mass Spectrometry Reviews 2010, 29,29-54.
(45) Posthumus,M.A.;Kistemker,P.G.;Meuzelaar,H.L.C.,Anal.Chem.,1978,50,985-991.
(46) Tabet,J.C.;Cotter,R.J.,Anal.Chem.,1984,56,1662-1667.
(47) Hoing,R.E.;Woolston,J.R.;Appl.Phys.Lett.,1963,2,138-139.
(48) Vastola,F.J.;Pirone,A.J.,Adv.Mass Spectrom.,1968,4,107-111.
(49) Vastola,F.J.;Mumma,R.O.;Pirone,A.J.,J.Org.Mass Spectrom.,1970,3,101-104.
(50) Overberg,A.;Karas.M.;Bahr,U.;Kaufmamm,R.;Hillenkamp,F.,Rapid Commun. Mass Spectrom.,1990,4,293-296.