臺灣博碩士論文加值系統

本論文乃研究當歸與黃耆對臍帶血中造血幹細胞 (CD34+ cells) 之增生與分化之影響，分三部份進行。第一部分的實驗中，我們確認多醣為當歸水萃液中與造血功能相關的活性成分，並以陰離子交換層析分離當歸粗多醣，得到四個不同的區分，其中 F 2 區分為主要的活性分布，能促進 GM-CSF、 IL-3 分泌，幫助 CFU-GM 的形成，其分子量介於 51.28 kDa 與 8.40 kDa 間，主要由阿拉伯糖、半乳糖及半乳糖醛酸所組成。第二部份我們將當歸與黃耆配伍使用，來探討藥材經配伍使用後，能否增進其藥效。結果顯示，多醣亦為黃耆成分中與造血活性相關的有效成分。雖然黃耆在配伍的比例中為主體，但其活性遠不如當歸多醣，但黃耆多醣能提供或是造成協同作用，導致兩藥材在配伍使用後，能同時促進 GM-CSF、 IL-3 及 M-CSF 等 HGF 的分泌，助於 CFU-GM 及 BFU-E 兩種集落的形成，並顯著提高 BFU-E 所佔的比例。第三部份，乃探討 F 2 區分及配伍藥方，在抑制劑 Adriblastina 的存在下，對於造血幹細胞提供之保護作用，結果顯示，配伍藥方比 F 2 區分能更有效的減緩抑制劑造成之傷害。

The aim of this research was to investigate the effects of Angelica sinensis (AS) and Astragalus membranaceus (AM) polysaccharides on proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells (CD34+ cells) from umbilical cord blood. This research was divided into three parts. In the first part, we confirmed that polysaccharides was the major hematopoietic component in the AS water extract. The Angelica sinensis polysaccharides (ASPS) were fractionated into four fractions by anion-exchange chromatography, and F 2 fraction had the highest hematopoietic activity among four fractions. The F2 fraction could stimulate secretion of hematopoietic growth factor (HGF), such as GM-CSF and IL-3, and promote colony-forming unit of granulocyte-macrophage (CFU-GM) formation. The molecular weight of F 2 fraction was between 51.28 kDa and 8.40 kDa, and composed of arabinose, galactose and galacturonic acid. In part II, we used the decoction - Danggui Buxue Tang (DBT), which is composed of AS and AM with weight ratio 1：5. We compared the hematopoietic activity of DBT, AS and AM, and found that the combination of AS and AM had synergizing on hematopoiesis, and AS and AM polysaccharides were the active component in DBT. DBT induced all HGF that we detected, including GM-CSF, IL-3 and M-CSF. Compared to F2 fraction, DBT could stimulate more kinds of HGF production, and this is the probably reason why DBT had higher hematopoietic effect than F2. DBT not only promoted the formation of CFU-GM but also promoted Burst-forming unit erythrocyte (BFU-E) colony formation. In part III, we compared the protective effect of F2 fraction and DBT against the damage caused by the chemotherapy drug Adriblastina. It was found that both the F 2 fraction and DBT rescued CD34+ cells viability and protected the colony formation ability of CD34+ cells. In this damage model, DBT was found to have better effects than F 2 fraction.

口試委員會審定書………………………………………………………………………………I
誌謝……………………………………………………………………………………………….II
中文摘要………………………………………………………………………………………… III
英文摘要…………………………………………………………………………………………. IV
第一章、 研究動機與目的………………………………………………………………………1
第二章、 文獻回顧………………………………………………………………………………..2
一、 當歸簡介……………………………………………………………………………………2
(一) 當歸的主要成分…………………………………………………………………………3
(二) 當歸多醣的藥理作用……………………………………………………………………4
(三) 黃耆………………………………………………………………………………………5
(四) 當歸補血湯………………………………………………………………………………6
二、 造血功能簡介…………………………………………………………………………………7
(一) 造血功能的定義、造血幹細胞及CD34+ cells……………………………………………7
(二) 造血系統…………………………………………………………………………………8
(三) 造血幹細胞分化途徑……………………………………………………………………9
(四) 造血相關成長因子……………………………………………………………………12
(五) 造血相關成長因子之受器及其訊息傳遞路徑……………………………………….14
(六) 造血功能評估-體外培養功能性評估 (in vitro culture functional assay)……………17
1. 集落形成分析 (Colony-forming unit assay, CFU assay)………………………….17
2. 原始細胞長期培養之分析 (Long-term culture initiating cell assay,LTC-IC assay……………………………17
三、粗多醣之區分方法
(一) 陰離子交換層析法 (Ion exchange chromatography)………………………………18
(二) 膠體過濾層析法 (Gel filtration)…………………………………………………….18
第三章、 當歸多醣造血功能評估……………………………………………………………….19
一、 實驗設計………………………………………………………………………………….19
二、 材料與方法……………………………………………………………………………….19
(一) 材料與藥品……………………………………………………………………………19
(二) 儀器設備……………………………………………………………………………20
(三) 實驗方法………………………………………………………………………………22
1. 實驗樣品之製備…………………………………………………………………….22
1-1 製備當歸/黃耆水萃液及當歸/黃耆粗多醣………………………………22
1-2 以陰離子交換層析法區分當歸粗多醣…………………………………22
1-3 以膠體層析過濾法進一步區分當歸多醣………………………………….22
2. 當歸水萃物總醣及總多醣含量的測定…………………………………………….23
3. 當歸多醣對造血功能的影響研究………………………………………………….24
3-1 製備人體單核球細胞條件培養液…………………………………………….24
3-2 集落生成分析 (Colony-forming assay)……………………………………….24
3-2.1分離臍帶血單核球細胞…………………………………………………….24
3-2.2自臍帶血單核球細胞中分離CD34+ cell(造血幹細胞) ……………………24
3-2.3 以CD34+cell(造血幹細胞)進行Colony-forming assay………………………26
4. 劑量、作用方式及不同刺激天數對造血功能的影響……………………………26
5. 集落型態觀察………………………………………………………………………27
6. 統計分析……………………………………………………………………………27
三、結果與討論………………………………………………………………………………….27
(一) 不同成份之半固態培養基對於集落形成的影響…………………………………27
(二) 當歸區分物對造血功能的影響……………………………………………………29
(三) 以陰離子交換層析法區分當歸粗多醣…………………………………………… 29
(四) 評估當歸多醣區分物對造血功能的影響……………………………………………30
(五) 膠體過濾層析法分離 F2 多醣……………….……………………………………31
第四章、 當歸、黃耆及當歸補血湯造血功能之比較…………………………………………40
一、 實驗構想……………………………………………………………………………………40
二、 材料與方法………………………………………………………………………………….41
(一) 材料與藥品…………………………………………………………………………41
(二) 儀器設備……………………………………………………………………………42
(三) 實驗方法………………………………………………………………………………44
1. 製備黃耆水萃液及黃耆粗多醣…………………………………………………44
2. 當歸補血湯之製備…………………………………………………………………44
3. 黃耆及當歸補血湯總醣含量的測定………………………………………………44
4. 複方及其單方造血功能的比較…………………………………………………….45
5. 劑量、作用方式及不同刺激天數對造血功能的影響………………….45
6. 集落觀察……………………………………………………………………………45
7. 細胞激素含量測定………………………………………………………………….45
8. 統計分析……………………………………………………………………………46
三、結果與討論…………………………………………………………………………………….46
(一) 複方及其單方造血功能的比較……………………………………………………46
(二) 黃耆區分物對當歸補血湯提供的效用……………………………………………47
(三) 當歸補血湯改變血相的功效………………………………………………………49
(四) 細胞激素測定………………………………………………………………………50
(五) 集落型態觀察………………………………………………………………………51
第五章、細胞損傷模式
一、實驗構想………………………………………………………………………………………63
二、Adriblastina (愛黴素)…………………………………………………………………………63
三、實驗方法………………………………………………………………………………………63
四、結果與討論……………………………………………………………………………………64
第六章、多醣基本特性之鑑定
一、 單醣組成……………………………………………………………………………………68
二、 蛋白質含量………………………………………………………………………………….70
三、 結果與討論…………………………………………………………………………………71
第七章、 結論……………………………………………………………………………………73
參考文獻……………………………………………………………………………………………74
附錄………………………………………………………………………………………………78

圖目錄
圖2-1、當歸藥材切片…………………………………………………2
圖2-2. 黃耆藥材切片………………………………………………………………………………5
圖2-3、各生長期的造血位置 (Betty et al., 2007)…………………………………………………9
圖 2-4、造血幹細胞分化的途徑 (Hoffbrand et al., 2005)………………………………………11
圖2-5、造血相關成長因子之受器結構 (Hoffbrand et al., 2005)…………………………………15
圖2-6、造血細胞經由細胞激素活化後的訊息傳導途徑 (Hoffbrand et al., 2005)………………16
圖2-7、膠體過濾層析法的原理 (莊，2005)………………………………………………………18
Fiq 3-1. MiniMACSTM Separator with LS column……………………………25
Fiq 3-2. MACS LS column……………………………26
圖3-1、比較商業化產品及實驗室配方之半固態培養基對 ASPS MNC-CM在臍帶血細胞集落形成的影響。…………32
圖3-2、經由顯微鏡觀察所得到的集落影像。……………………………………………………33
圖3-3、當歸水萃物及當歸多醣單核球細胞條件培養液對 CD34+ cells 集落形成的影響。…34
圖3-4、以連續梯度的溶離方式利用陰離子交換層析分離水溶性當歸多醣的層析圖。………35
圖3-5、以階段梯度的溶離方式利用陰離子交換層析法分離水溶性當歸多醣的層析圖及各區分所佔比例。…………………………………36
圖3-6、不同當歸多醣區分之成人單核球細胞條件培養液對 CD34+ cells 集落形成之影響。……………37
圖3-7、利用膠體過濾層析法分離水溶性當歸多醣中的 Fraction 2 多醣所得之層析圖。……………………………………38
圖3-8、利用膠體過濾層析法分離水溶性當歸多醣中的 Fraction 2 多醣所得的層析圖。……………………………………39
圖4-1、當歸補血湯、當歸及黃耆等不同水萃物之成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells 集落形成之影響。……………………52
圖4-2、當歸補血湯及當歸多醣之成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells集落形成之影響。……………………………………………………53
圖4-3、當歸多醣及不同黃耆水萃物區分之成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells集落形成之影響。……………………………54
圖4-4、當歸多醣混合不同黃耆水萃物區分之成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells集落形成之影響。………………………………55
圖4-5、當歸補血湯及當歸多醣混合不同黃耆水萃物區分之成人單核球細胞條件培養液對 CD34+ cells 集落形成之影響。…………………………56
圖4-6、當歸多醣成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells形成CFU-GM及BFU-E集落的影響。……………………………………………………………………57
圖4-7、當歸補血湯成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells形成 CFU-GM及 BFU-E 集落的影響。…………………………………………………………………58
圖4-8、當歸補血湯及當歸多醣成人單核球細胞條件培養液對CD34+ cells形成CFU-GM及BFU-E集落的影響。………………………………………………59
圖4-9、當歸多醣經陰離子交換區分後刺激成人周邊血單核球細胞五天之條件培養液中GM-CSF的含量。………………………………………………………………60
圖4-10、當歸補血湯之區分刺激成人周邊血單核球細胞五天之條件培養液中GM-CSF的含量。……………………………………………………………………61
圖5-1、當歸補血湯及當歸多醣中 F 2 區分之成人單核球細胞條件培養液在抑制劑 Adriblastina 的作用下對於 CD34+ cells 所提供的保護效果。………………65
圖5-2、當歸補血湯及當歸多醣中 F 2 區分之成人單核球細胞條件培養液在抑制劑 Adriblastina 的作用下對於 CD34+ cells 所提供的保護效果。………………66
圖5-3、顯微鏡底下看到的不同集落影像。………………………………………………………67

表目錄
表2-1、造血相關的細胞激素以及所影響的細胞類型 (Hoffbrand et al., 2005)………………13
表4-1、當歸多醣及當歸補血湯中各區分刺激成人周邊血單核球細胞五天之條件培養液中IL-3及M-CSF的含量。…………………………62
表6-1、當歸粗多醣經由陰離子交換樹脂DEAE-Sepharose CL-6B分離後，各區分之產率，蛋白質含量及單糖組成。………………………72

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