|
柑橘南美立枯病病毒(citrus tristeza virus,CTV) 為一嚴重影響柑橘栽培之世界
性病原，最早發現於南非，其後世界各主要柑橘產區均陸續發現其為害。本省栽培
之柑橘雖罕見典型南美立枯病病徵，然普遍有tristeza病毒感染，為無病徵之帶毒
植株，對柑橘產業之潛在威脅不容忽視。本研究之主要目的在針對存在本省柑橘之
CTV ，建立一快速準確的偵測技術，希望對於CTV 的檢測及病害管理能有所裨益。
有鑑於本病毒顆粒甚長且純化至為困難之特質，擬進行之基因選殖工作乃以性狀較
安定且易於分離純化之病毒複製型ds-RNAs 為起始材料。本研究係利用本研究室改
進Morris及Dodds 氏之CF-H纖維素親合層析方法，並以農試所提供之枸櫞罹病植株
為材料。研究中發現，。取過程中若將SDS 的濃度提高為三倍，對於ds-RNAs 的收
量會有顯著提昇的效果。利用此改良技術可自每克鮮重CTV 罹病枸櫞葉柄中純化得
0.1 ug之ds-RNAs 。鞘蛋白基因選殖用之cDNA合成係以末端添加poly A序列的方式
進行，上述萃取純化獲得之病毒ds-RNA分子，於3'末端添加poly A序列後，以其為
起始點反轉錄合成cDNA，繼而利用Stratagene公司之ZAP-XR基因選殖試劑組及由農
試所提供之CTV 鞘蛋白對應抗血清，選殖稍蛋白基因至p-Bluescript載體中。利用
此法，目前已成功選殖到六個具分泌稍蛋白能力之Escherichia coli XL1-Blue 選
殖株，其中CP-16 選殖株並已完成其CTV 全長稍蛋白基因之解序，證實與甫近Seki
ya氏等報告之CTV 鞘蛋白基因序列相同度(identity)達98.7%;其對應胺基酸序列相
同度與相似度(similarity)則分別為97.8% 及98.65%。由此CP-16 選殖株所產生之
CTV 鞘蛋白，經以Bio-Rad 公司之Prep Cell 製備級電泳裝置自菌培養液中將其純
化出來，並進一步成功地製備抗血清，以西方漬染法已初步證實偵測CTV 之效果相
當良好。利用此選殖株產生之稍蛋白鳥抗原來製備抗血清，最主要之優點，一則可
避免病毒純化的麻煩，另則可免去所製成血清含有植物成份的干擾。除血清偵測技
術之應用外，利用CP-16 所含之CTV 鞘蛋白基因核酸片段為模版，以random primi
ng方式製成之DIG 核酸探針，實際以北方墨點漬染法測試，發現可明顯區別同屬於
closterovirus 群之CTV 與GLRV( 葡萄捲葉病毒 )，其與CTV ds-RNAs 之難合靈敏
度可達2ng 以下。為增進核酸偵測技術之靈敏度，利用PC Gene 套裝軟體分析搜尋
可供RT-PCR偵測用之引子(primer)序列，由所獲資料中選用CP16-1(-10到10的序列
) 及CP16-4( 對應668 到648 的序列 )兩引子，已證實可利用RT-PCR方法將CTV 鞘
蛋白基因中678 bps 的核酸片段正確地增幅，利用此法可偵測之ds-RNA靈敏度可達
1X10-14g(10fg)以下，未來在CTV 之偵測應用上極值得推薦。
|