臺灣博碩士論文加值系統

台灣肉鴨以土番鴨 (Mule duck) 為最大宗飼養種類，土番鴨為透過鴨屬 (Anas platyrhynchos) 與棲鴨屬 (Cairina moschata) 行屬間雜交生產而得。在台灣毛色為土番鴨重要之經濟性狀，但由於土番鴨為屬間雜交種，因此改良土番鴨毛色性狀為親代種鴨選拔之重點。第一型黑色素皮質素受體（melanocortin 1 receptor, MC1R） 基因在黑色素生成中扮演調節真黑色素與偽黑色素生成之角色，而刺鼠信號蛋白 (agouti signalling protein, ASIP) 為 MC1R 在生成黑色素途徑時之拮抗劑。本研究之目的乃應用 PCR-RFLP 與 SB-ASA 檢測 ASIP 與 MC1R 基因之單核苷酸多型性 (single nucleotide polymorphism, SNP)，建立土番鴨親代育種選拔標幟檢測技術，並調查選拔族群與保種族群菜鴨之 ASIP 與 MC1R 基因型之差異 。本研究發現棲鴨屬之 ASIP 基因 exon 4 與 MC1R 基因 exon 1 分別具有 c.342 C>A 與 c.274 G>A 之多型性；於鴨屬之 ASIP exon 1、intron 3 與 MC1R 基因 exon 1 則分別具有 g.83109 T>C、g.106353-57→GTAAG 與 c.52 G>A、c.376 G>A 與 c.409 G>A 之多型性。本研究透過基因變異性以與多重序列比對分析後發現，ASIP 與 MC1R 基因在鳥禽類物種具有很高之遺傳保守性 (hereditary conservation)。此外，於 ASIP 基因外顯子與內含子所發現之 2 個 SNPs 位點與 1 個插入/缺失 (insertion/deletion, I/D) 位點，經配種親代族群之基因型分析，並經卡方獨立性檢定確認於外顯子發現之 2 個 SNPs 位點與土番鴨毛色無關聯性 (P>0.05)，而於內含子所發現之 I/D 位點則與土番鴨毛色具有關聯性 (P<0.05)；於鴨屬所發現之多型性位點 c.52 G>A、c.376 G>A 與 c.409 G>A 經基因型分析後，可明顯區分出保種與選拔族群之母菜鴨，並且發現 c.52 G>A 、 c.376 G>A 與 c.409 G>A 此 3 個多型性位點具有聯鎖性，再進一步分析子代土番鴨，發現可作為區別土番鴨毛色之遺傳標幟 (P<0.05)；另外，在棲鴨屬所發現之多型性位點 c.274 G>A 經子代土番鴨基因型分析，認此多型性位點與土番鴨毛色具有關聯性 (P<0.05)。綜上所述，白色菜鴨 ASIP 基因 intron 3 g.106353-57→GTAAG 與 MC1R 基因 c.52 G>A、 c.376 G>A 與 c.409 G>A 多型性，以及番鴨 c.274 G>A 多型性均與其後裔土番鴨毛色有關，可作為毛色選拔之基因標誌。

The mule ducks, the progeny from a cross of two species with the Tsaiya ducks (Anas platyrhynchos) and Muscovy drakes (Cairina moschata), is a common meat duck breed in Taiwan. Plumage color is an important economic trait of mule duck, so improving the plumage color trait is important for the breeding. The melanocortin 1 receptor (MC1R) plays a major role for producing eumelanin and pheomelanin, and the agouti signalling protein (ASIP) acts as an inverse agonist at MC1R.
The aim of this study was to apply high resolution melting (HRM) and DNA sequencing to analysis of variability and examine the SNPs in ASIP and MC1R genes in difference breed ducks. We established the marker-assisted selection by polymerase chain reaction (PCR) technique combined with the restriction fragment length (RFLP), and single-tube bi-directional allele specific amplification (SB-ASA) to detect the nsSNP (non-synonymous SNP) of ASIP and MC1R genes which may be used to improve the selection of the mule duck's parents.
The results showed that two nsSNPs (ASIP gene exon 4 c.342 C>A and MC1R gene exon 1 c.274 G>A) were identified in Muscovy drakes, and four nsSNPs (ASIP gene exon 1 g.83109 C>T; MC1R gene exon 1 c.52 G>A, c.376 G>A, and c.409 G>A) and one insertion/deletion (ASIP gene intron 3 g.106353-57→GTAAG) in Tsaiya ducks. Genetic variability and multiple sequence alignment analysis showed that the coding DNA sequence of ASIP and MC1R genes were high hereditary conservation in fowls. Genotyping experiments of the ASIP gene revealed significant associations with the genetic variations of the ASIP gene [intron 3 g.106353-57→GTAAG (5 bp deletion)] in the 2 different populations of Tsaiya ducks in this study (P<0.05). While exon 1 g.83109 C>T and exon 4 c.342 C>A SNPs in the ASIP gene weren't significantly associated between mule ducks and different Tsaiya ducks population. In MC1R gene, four non-synonymous SNPs, c.52 G>A, c.274 G>A, c.376 A>G, and c.409G>A, were associated with the two population of Tsaiya ducks on plumage color genotype (P<0.01), and associated with the mule ducks on plumage color phenotypes (P<0.05). Our results indicate that the identified polymorphisms by this study can be used as genetic markers in plumage color selection for mule duck's parents.
In conclusion, we confirmed ASIP gene intron 3 g.106353-57→GTAAG and MC1R gene c.52 G>A, c.376 A>G, and c.409G>A in Tsaiya ducks, and MC1R gene c.274 G>A in the Muscovy drakes. Variations in these polymorphisms were investigated for possible use in genetic markers of plumage color selective breeding.

中文摘要 Ⅰ
Abstract Ⅱ
致謝 IV
圖次 VIII
表次 IX
附次 X
壹、前言 1
貳、文獻探討 2
一、台灣養鴨產業概況 2
二、台灣常見鴨種 2
(一) 純種品系 2
1. 鴨屬 2
2. 棲鴨屬 4
(二) 商用雜交品系 4
1. 土番鴨 4
2. 改鴨 4
三、白色土番鴨親代之選育 5
四、鴨毛色調控機制 5
(一) 黑色素之分類 5
(二) 黑色素之生成機制 6
五、黑色素生成主要候選基因 6
(一) 第一型黑色素皮質素受體 6
(二) 刺鼠信號蛋白 8
(三) 酪胺酸酶基因家族 8
(四) 小眼球相關轉錄因子 8
(五) 其他相關基因 9
六、基因篩選與檢測技術 9
(一) 單股核苷酸構形多型性 10
(二) 限制片段長度多型性 10
(三) 高解析度熔解曲線分析法 10
(四) 單管雙向等位基因專一性擴增法 11
(五) 生物晶片 11
叄、材料與方法 12
一、試驗大綱流程 12
二、試驗樣品 13
(一)配種試驗 13
(二)血液樣本 13
(三)組織樣本 13
三、核酸萃取 13
(一)血液 DNA 之萃取 13
(二)組織 DNA 之萃取 14
四、核酸品質之確立 14
(一)瓊脂糖膠 (Agarose gel) 電泳 14
(二)超微量分光光度計 14
五、聚合酶鏈鎖反應 14
(一)引子之設計 14
(二)PCR 反應條件之確立 15
(三)高解析度熔點分析法評估 15
(四)土番鴨性別鑑定 15
六、PCR 產物之純化 18
(一)酒精沉澱法 18
(二)DNA膠體回收純化 18
七、DNA定序 18
八、分析基因多型性之技術 19
(一)限制片段長度多型性 (RFLP) 19
(二)擴增創造限制酵素切位法 (ACRS) 19
(三)單管雙向等位基因專一性擴增法 (SB-ASA) 19
九、基因序列之差異性分析 19
十、統計分析 19
肆、結果 25
一、應用 HRM 分析 ASIP 與 MC1R 基因多型性 25
二、白色番鴨之基因多型性 25
(一)ASIP 與 MC1R 基因之多型性 25
(二)建立 PCR-RFLP 分析 MC1R 基因 c.274 G>A 多型性 25
(三)建立 SB-ASA 分析 ASIP 基因 exon 4 c.342 C>A 多型性 30
三、白色菜鴨之基因多型性 30
(一)ASIP 與 MC1R 基因之多型性 30
(二)建立 PCR-RFLP 分析白色菜鴨 ASIP 與 MC1R 基因多型性 30
(三)建立 PCR-HRM 分析 ASIP 基因 intron 3 g.106353-57→GTAAG 之多型性 40
(四)建立 PCR-ACRS 分析 MC1R 基因 c.52 G>A 多型性 40
四、ASIP 與 MC1R 基因序列之變異性分析 40
(一) 白色菜鴨與白色番鴨之變異性分析 40
(二) 白色菜鴨、白色番鴨與其他物種之多重序列分析 47
五、ASIP 與 MC1R 基因多型性位點與土番鴨親代白菜鴨之關係 47
(一)ASIP 基因exon 1 g.83109 C>T 與 intron 3 g.106353-57→GTAAG 47
(二)MC1R 基因c.52 G>A、c.274 G>A、c.376 G>A 與 c.409 G>A之多型性 47
六、白色菜鴨後裔土番鴨毛色之鑑定 54
(一)土番鴨毛色鑑定 54
(二)土番鴨性別鑑定 54
(三)土番鴨性別差異與毛色等級之比較 54
七、白色番鴨 ASIP 與 MC1R 基因多型性與後裔土番鴨毛色之關係 60
(一)ASIP 基因 exon 4 c.342 C>A 多型性 60
(二)MC1R 基因 c.274 G>A 多型性 60
八、白色菜鴨 ASIP 與 MC1R 基因多型性與後裔土番鴨毛色之關係 60
(一)ASIP 基因 exon 1 g.83109 C>T 與 intron 3 g.106353-57→GTAAG 之多型性 60
(二)MC1R 基因 c.52 G>A、c.376 G>A 與 c.409 G>A 之多型性 65
(三)單倍型頻率分析 65
(四)土番鴨 MC1R 基因單倍型與毛色之關係 65
伍、討論 70
一、鴨 ASIP 與 MC1R 基因多型性比較分析 70
二、ASIP 與 MC1R 基因多型性與土番鴨毛色之關係 71
三、黑色素生成機制相關基因與鴨毛色之關係 72
陸、結論 73
柒、參考文獻 74

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