臺灣博碩士論文加值系統

由台灣北部土壤分離出一株在pH7.0、30℃能以3％的蝦蟹殼粉為主要碳源之蛋白質生產菌，Bacillus subtilis Y-108。而以蝦蟹殼粉為Bacillus subtilis Y-108生產蛋白質之主要碳源，發現當蝦蟹殼粉為7％、K2HPO4 0.1％、MgSO4‧7H2O 0.05％、arabinose 1％、NaNO3 0.5％及CaCl2 1.5％，用磷酸緩衝液（pH6）培養體積為100mL加入於250mL之三角錐瓶中，在30℃之培養箱培養三天，可獲得最大之蛋白質分解活性。其活性比未經最適生長條件探討之前的活性（0.17U/mL）提昇約50倍左右（8.64U/ml）。
以最適蛋白質生產條件來做微生物去蛋白質時發現，以液態培養來去除天然蝦殼、蟹殼、龍蝦殼及花枝螵蛸之蛋白質，其蛋白質去除率依序分別可達88％、73%、84%及75%，而經酸處理過之蝦殼、蟹殼及龍蝦殼，其蛋白質去除率則分別為76%、62%及59%。與其他微生物（例如：Pseudomonas maltophilia、Bacillus subtilis）比較時，其效果都高出許多。
利用Bacillus subtilis Y-108之蛋白質最適生產條件生產蛋白質，經硫酸銨沉澱、透析後，進行DEAE-Sephacel離子交換層析、Sephacryl S-200膠體層析及chromatofocusing一連串純化分離的步驟。所純化分離出之蛋白質 純度約為未純化分離前的37倍左右。經純化分離出來之蛋白質 在40℃、pH 6∼9之內酵素都能保持穩定狀態，而最適反應溫度及最適反應pH值分別為50℃及pH 8。進行SDS-PAGE電泳分析及Sephacryl S-200膠體層析可知其分子量約為44KDa左右。
利用Bacillus subtilis Y-108所生產之蛋白質可共價鍵結於一個隨pH值改變可溶性質的高分子聚合物AS-L上。此固定化酵素可在pH5.5以上時完全溶解，在pH4.5以下則完全不溶解。在使用粗酵素液做固定化研究時，可達81％之活性固定化率（Protesae 80%、Ficin 78%、Bromelain 49%、Papain 34%）及59%之蛋白質固定化率（Protease 7%、Ficin 53%、Bromelain 32%、Papain 42%）。固定化後之pH及溫度安定性為pH6~7、50℃，而最適pH及溫度為pH8、50℃。

The fermentation broth of the protease bacterium Bacillus subtilis Y-108 , was isolated from soil in the northern Taiwan. Under the optimized culture condition that the culture was shaken in 250 mL Erlenmeyer flasks with 100 mL medium （7％shrimp and crab shell powder（SCSP）, 0.1％K2HPO4, 0.05％MgSO4, 1.0％arabinose, 1.5％NaNO3 , and 1.5％CaCl2 , pH 6.0 adjusted by phosphate buffer solution）at 30℃for 3 days, the protease activity of Bacillus subtilis Y-108 was as high as 8.64U/mL. It was about fifty fold of the activity （0.17U/mL）of Bacillus subtilis Y-108 under the unoptimized basal culture condition.
The protease of Bacillus subtilis Y-108 in the optimum produce condition was used to test as protein cleaner. In liquid state culture, the efficiency of deproteinization of NSS（natural shrimp shell）、crab、lobster and squid was 88％、73%、84% and 75%, then after acid treated the NSS、crab and lobster was up to 76％、62% and 59%. In comparison with Pseudomonas maltophilia and Bacillus subtilis（CCRC10029、11602、16048）, the efficiency of protein cleaning of marine waste for Bacillus subtilis Y-108 are the highest one.
The protease of Bacillus subtilis Y-108, produced under the optimized culture condition, the first step was precipitated and dialyzed by using ammonium sulfate. The further purification and separation procedures of the protease were processed by the use of DEAE-Sephacel ionic exchange chromatography、Sephacryl S-200 gel permeation chromatography and chromatofocusing. Purification was 37-fold with the crude enzyme solution. After purification and separation, the activity of the protease was still stable at 40℃and pH 6∼9, while the optimal temperature and pH for the enzyme reaction were at 50℃and pH 8, respectively. By SDS-PAGE electrophoresis and gel permeation chromatography, the molecular weight of the protease was identified as 44KDa.
The protease produced from Bacillus subtilis Y-108 can covalently linked to the supporting AS-L（hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate）polymers. Therefore, the crude solution of protease was used for enzyme immobilization with the AS-L polymer carriers. The efficiency of enzyme activity immobilization was 81％（Protease 80%、Ficin 78%、Bromelain 49%、Papain 34%）, and the protein immobilization was 59%（Protease 7%、Ficin 53%、Bromelain 32%、Papain 42%）. The pH- and heat-stability ranges of the immobilized enzyme were at pH 6∼7 and 50℃, respectively. The optimal enzyme reaction for the immobilized protease activity were under 50℃and pH 8.

目 錄
封面內頁
簽名頁
授權書 iii
中文摘要 v
英文摘要 vii
誌謝 ix
目錄 x
圖目錄 xvi
表目錄 xx
第一章 緒言 1
第二章 文獻回顧 4
2.1 幾丁質之發現及分布 4
2.2 幾丁質之構造 7
2.3 幾丁質之物理和化學性質 9
2.3.1 物理性質 9
2.3.2 化學性質 10
2.4 蛋白質之發現及特性 11
2.4.1 蛋白質的發現 11
2.4.2 蛋白質的分類 12
2.4.3 蛋白質的一般性質 14
2.5 蛋白質的應用 15
2.5.1 醫學方面 17
2.5.2 食品方面 17
2.5.3 其他方面 19
2.6 酵素固定化 20
2.6.1 固定化的方法 20
2.6.2 利用固定化增加酵素之穩定性 23
2.6.3 穩定性的探討 23
2.7 固定化酵素之擔體 27
2.7.1 非可溶型擔體 27
2.7.2 可逆溶解型擔體 30
2.8 利用AS-L可逆溶解型擔體作固定化研究 31
2.8.1 使用的固定化擔體系統 31
2.8.2 使用化學活性劑 34
第三章 蛋白質生產菌之篩選與鑑定 36
3.1 前言 36
3.2 實驗材料與方法 36
3.2.1 化學材料 36
3.2.2 生產菌株之分離與篩選 36
3.2.3 蛋白質活性測定方法 37
3.2.4 蛋白質生產菌之菌學鑑定 37
1) 初步測試 37
2) 菌體脂肪酸分析 38
3) 微生物鑑定系統 38
4) API 20E與API 50 CHB鑑定套組 38
3.3 結果與討論 39
3.3.1 蛋白質生產菌之篩選 39
3.3.2 菌株鑑定 39
3.3.3 結語 40
第四章 Bacillus subtilis Y-108之最適蛋白質生產條件 41
4.1 前言 41
4.2 實驗材料與方法 41
4.2.1 微生物材料 41
4.2.2 化學材料 41
4.2.3 蛋白質活性測定方法 42
4.2.4 蛋白質最適生產條件探討 42
4.2.5 綜合比較 44
4.4 結果與討論 44
第五章 Bacillus subtilis Y-108醱酵水產廢棄物生產蛋白質及其蛋白質去除率之探討 61
5.1 前言 61
5.2 實驗材料與方法 62
5.2.1 微生物材料 62
5.2.2 化學材料 62
5.2.3 蛋白質定量分析 63
5.2.4 酸處理 63
5.2.5 鹼處理 63
5.2.6 含水量的測定 63
5.2.7 微生物以液態培養進行蛋白質去除率之探討 64
5.2.8 進行灰燼處理 64
5.2.9 幾丁質回收率 64
5.3 結果 65
5.3.1 各種水產廢棄物之含水量 65
5.3.2 各種水產廢棄物經微生物去蛋白之效果 65
5.3.3 幾丁質的回收 70
第六章 蛋白質的純化與分離 83
6.1 前言 83
6.2 實驗材料與方法 83
6.2.1 微生物材料 83
6.2.2 化學材料 84
6.2.3 蛋白質活性測定方法 84
6.2.4 蛋白質之純化分離 84
1) 大量培養及離心 84
2) 硫酸銨沉澱 85
3) 離子交換樹脂層析法 85
4) 分子量標定與膠體過濾層析 86
6.2.5 胺基酸組成分析 86
6.2.6 電泳分析 86
6.2.7 等電點之測定 87
6.2.8 各種基質對酵素之影響 88
6.2.9 熱安定性及最適反應溫度測試 88
6.2.10 pH安定性及最適反應pH值測試 88
6.3 結果與討論 88
6.3.1 粗酵素液的製備 88
6.3.2 離子交換管柱層析法 90
6.3.3 分子量標定與膠體過濾層析法 92
6.3.4胺基酸組成分析 96
6.3.5 電泳分析 96
6.3.6 等電點 96
6.3.7 各種基質對酵素活性之影響 96
6.3.8 純化後蛋白質之最適反應溫度及熱安定性 96
6.3.9 純化後蛋白質之最適反應pH值及pH安定性 104
第七章 Bacillus subtilis Y-108醱酵蝦蟹殼粉所生產蛋白質與市售蛋白質固定化之研究 107
7.1 前言 107
7.2 實驗材料與方法 107
7.2.1 化學材料 108
7.2.2 粗酵素液的製備 109
7.2.3 酵素固定化 109
7.2.4 蛋白質活性測定方法 109
7.2.5 蛋白質定量分析 110
7.2.6 pH值對游離和固定化酵素活性及穩定性的影響 110
7.2.7 溫度對游離和固定化酵素活性及穩定性的影響 110
7.2.8 酵素與市售蛋白質其蛋白質及活性固定量之比較 110
7.3 結果與討論 111
7.3.1溫度對酵素活性及安定性的影響 111
7.3.2 pH值對酵素活性及安定性的影響 114
7.3.3 酵素與市售蛋白質其蛋白質及活性固定量之比較 115
第八章 結論 119
8.1 Bacillus subtilis Y-108之最適蛋白質生產條件 119
8.2 利用Bacillus subtilis Y-108進行各種水產廢棄物之蛋
白質去除率的探討 120
8.3 蛋白質之純化與分離 120
8.4 Bacillus subtilis Y-108醱酵析蟹殼粉生產蛋白質與
市售蛋白質固定化之研究 121
參考文獻 122
圖目錄
第二章 文獻回顧
圖2.1 幾丁質之化學構造 8
圖2.2 纖維素、幾丁質以及幾丁聚醣之化學構造 8
圖2.3 酵素的各種固定化法 22
圖2.4 酵素熱展開的概念圖 26
圖2.5 AS-L之化學結構式 32
圖2.6 EDC之化學結構 35
圖2.7 EDC、AS-L擔體和酵素間的化學反應 35
第四章 Bacillus subtilis Y-108之最適蛋白質生產條件
圖4.1 蝦蟹殼粉添加量對蛋白質活性之影響 45
圖4.2 不同碳源添加量對蛋白質活性之影響 48
圖4.3 氮源添加量對蛋白質活性之影響 51
圖4.4 無機鹽類添加量對蛋白質產量之影響 53
圖4.5 pH值對蛋白質活性之影響 55
圖4.6 溫度對蛋白質活性之影響 56
圖4.7 充填體積對蛋白質產量之影響 58
圖4.8 培養時間對蛋白質產量之影響 59
第五章 利用Bacillus subtilis Y-108 醱酵水產廢棄物生產蛋白質及其蛋白質去除率之探討
圖5.1 微生物醱酵蝦殼去蛋白之比較 67
圖5.2 微生物醱酵斜殼去蛋白之比較 68
圖5.3 微生物醱酵龍蝦殼去蛋白之比較 69
圖5.4 微生物醱酵烏賊螵蛸去蛋白之比較 72
圖5.5 天然蝦殼（A）；經微生物處理後之天然蝦殼（B） 76
圖5.6 酸處理過之天然蝦殼（A）；經微生物處理後之酸蝦
殼（B） 76
圖5.7 天然蟹殼（A）；經微生物處理過之蟹殼（B） 77
圖5.8 酸處理之蟹殼（A）；經微生物處理後之酸蟹殼（B） 77
圖5.9 天然龍蝦殼（A）；經微生物處理後之龍蝦殼（B） 78
圖5.10 酸處理後之龍蝦殼（A）；經微生物處理後之酸龍
殼（B） 78
圖5.11 天然烏賊螵蛸（A）；經微生物處理後之烏賊螵蛸
（B） 79
圖5.12 烏賊螵蛸之電顯圖（×300）（A）；經微生物處理
後烏賊螵蛸之電顯圖（×300）（B） 79
圖5.13 蝦殼之電顯圖（×300）（A）；經微生物處理後蝦
殼之電顯圖（×300）（B） 80
圖5.14 酸處理過蝦殼之電顯圖（×5000）（A）；經微生
物處理後之酸蝦殼之電顯圖（×5000）（B） 80
圖5.15 蟹殼之電顯圖（×300）（A）；經微生物處理後蟹
殼之電顯圖（×300）（B） 81
圖5.16 酸處理過蟹殼之電顯圖（×300）（A）；經微生物
處理後之酸蟹殼之電顯圖（×300）（B） 81
圖5.17 龍蝦殼之電顯圖（×5000）（A）；經微生物處理
後龍蝦殼之電顯圖（×5000）（B） 82
圖5.18 酸處理過龍蝦殼之電顯圖（×300）（A）；經微生
物處理後之酸龍蝦殼之電顯圖（×300）（B） 82
第六章 蛋白質的分離與純化
圖6.1 Bacillus subtilis Y-108所生產蛋白質之純化分離流程圖
89
圖6.2 DEAE Sephacel 之蛋白質層析圖譜 91
圖6.3 分子量標準品於Sephacryl S-200之層析圖譜 93
圖6.4 Sephacryl S-200 之蛋白質層析圖譜 94
圖6.5 蛋白質之SDS-PAGE 98
圖6.6 SDS-PAGE分子量與相對移動速率之關係 99
圖6.7 蛋白質之等電點層析圖譜 100
圖6.8 蛋白質純化前後之熱安定性（pH7.0） 102
圖6.9蛋白質純化前後之最適反應溫度（pH7.0） 103
圖6.10 蛋白質純化前後之pH安定性（37℃） 105
圖6.11 蛋白質純化前後之最適反應pH值（37℃） 106
第七章 Bacillus subtilis Y-108醱酵蝦蟹殼粉生產蛋白質與市售蛋白質固定化之研究
圖7.1 各種蛋白質的游離酵素和固定化酵素之pH安定性
112
圖7.2 各種蛋白質的游離酵素和固定化酵素之最適反應
pH值 113
圖7.3 各種蛋白質的游離酵素和固定化酵素之熱安定性
116
圖7.4 各種蛋白質的游離酵素和固定化酵素之最適反應
溫度 117
表目錄
第二章 文獻回顧
表2.1 一些甲殼類昆蟲軟體動物器官和真菌之幾丁質含量 5
表2.2 列出一些工業上常見蛋白質及一些特性 13
表2.3 一些工業上重要的鹼性蛋白質 16
表2.4各種蛋白質在醫學上之治療概況 18
表2.5 各種固定化法的優缺點 24
表2.6 以不同固定化模式修飾鹼性蛋白質之穩定性 25
表2.7 提高熱穩定性的酵素種類 28
表2.8 對熱穩定性有負面影響的酵素種類 28
表2.9 不同固定化酵素的保存穩定性 29
表2.10 固定化酵素於填充床的操作穩定性 29
表2.11 AS-L的性質說明 33
第四章 Bacillus subtilis Y-108之最適蛋白質生產條件
表4.1 不同碳源對蛋白質活性之影響 47
表4.2 氮源對蛋白質產量之影響 49
表4.3 無基鹽對蛋白質活性之影響 52
表4.4 探討前後之培養基組成及培養條件之比較 60
第五章 利用Bacillus subtilis Y-108醱酵水產廢棄物生產蛋白質及其蛋白質去除率之探討
表5.1 各種水產廢棄物之含水量 66
表5.2 各種水產廢棄物經微生物醱酵去蛋白之比較 73
表5.3 水產廢棄物幾丁質回收率 74
第六章 蛋白質的純化與分離
表6.1 Bacillus subtilis Y-108所生產蛋白質之純化概要 95
表6.2 蛋白質經純化後其胺基酸之組成 97
表6.3 各種基質對蛋白質活性之影響 101
第七章 Bacillus subtilis Y-108醱酵蝦蟹殼粉生產蛋白質與市售蛋白質固定化之研究
表7.1 酵素與市售蛋白質固定化後其蛋白質及活性固定
化量之比較

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