臺灣博碩士論文加值系統

基質輔助脫附游離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS）具有準確、快速、高靈敏度等優點，在蛋白質體學分析上是不可或缺的工具。傳統膠體蛋白質消化反應極為耗時的缺點，以微波輔助處理蛋白質可在幾分鐘內完成分析，本實驗利用trypsin在H218O進行蛋白質消化反應，將18O標定在peptide的c-terminus，使得該片段平移+4 Da當作內標準品，並將微波消化過後的樣品與內標準品等量混合，由質譜圖求出消化率，本實驗在15min內及70oC下可得到最大的消化率。而家用微波　爐也可以運用在in gel digestion上，成功的鑑定標準品及未知樣品。

摘要 i
目錄 ii
圖目錄 v
表目錄 x
壹、緒論 1
1.前言 1
2.質譜儀的原理 3
3.基質輔助雷射脫附游離法 4
4.蛋白質電泳 11
5.一維膠體製備方式 13
6.In-gel digestion 14
7.微波（Microwave） 15
8.蛋白質定量方法 19
9.ICAT（isotope-coded affinity tag） 21
10.Stable isotope labeling(SIL) 23
貳、實驗目的 24
參、實驗 25
1.藥品 25
2.儀器 25
3.微波輔助消化coomasssie blue stain一維膠體 27
4.微波輔助消化silver stain一維膠體 28
5.真實樣品 29
6.內標準品製備方式 32
7.利用18O標定後的內標準品計算分析物消化率的步驟 33
8.實驗流程圖 34
9.coomasssie blue stain的膠體實驗 35
10. silver stain的膠體實驗 36
11.蛋白質的消化率實驗 38
12.對Lysozyme以消化時間及溫度為變數定量實驗 40
13.恆溫微波裝置對蛋白質做乙醯胺化反應 42
14.以傳統方式對蛋白質做乙醯胺化反應 43
肆、結果與討論 44
4. 1利用聚焦式恆溫微波裝置或家用微波爐幫助蛋白質乙醯胺化反應 44
4.2以微波消化時間及溫度為變數找出Lysozyme最佳消化條件 65
4.3以微波對多種蛋白質做消化效率之實驗 69
4.4家用微波爐也可運用在in gel digestion 72
伍、結論 79
陸、參考文獻 80
柒、附錄 83


圖目錄
圖 一、分析物離子化過程。 7
圖 二、Time of flight mass analyzer。 8
圖 三、不同物質對微波的吸收度。 16
圖 四、Focused type microwave system。 18
圖 五、質譜儀分析活體內標定分析物之步驟。 21
圖 七、蛋白質水解過程中將18O標定進入胜肽步驟。 23
圖 八、老鼠腦部不施加電擊脈衝，取其腦部萃取物質經二維電泳分離出的蛋白質。 29
圖 九、老鼠腦部施加電擊脈衝，取其腦部萃取物質經二維電泳分離出的蛋白質。 30
圖 十、老鼠未服用治療精神分裂症患者藥物，取其腦部萃取物質經二維電泳分離出的蛋白質。 30
圖 十一、老鼠服用治療精神分裂症患者藥物，取其腦部萃取物質經二維電泳分離出的蛋白質。 31
圖 十二、（A）Lysozyme以微波輔助乙醯胺化。（B）以傳統方式乙醯胺化Lysozyme。（C）無乙醯胺化Lysozyme。 46
圖 十三、DTT微波溫度設定（60，70，75，80，90）oC微波1min，IAA微波溫度設定70oC微波1min。 47
圖 十四、DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定 (60，70，80）oC微波1min。 48
圖 十五、DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波（20，30，40，50）秒。 49
圖 十六、DTT微波溫度設定80oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波（10，20，30，40，50）秒。 50
圖 十七、DTT溫度設定90oC微波（10，20，30，40，50）秒，IAA微波溫度設定70oC微波1min。 51
圖 十八、DTT溫度設定（80，90）oC微波1min，IAA微波溫度設定70oC微波1min。 52
圖 十九、DTT溫度設定80oC微波（10，20，30，40，50）秒，IAA微波溫度設定70oC微波1min。 53
圖 二十、DTT溫度設定（60，70，75）oC微波1min，IAA微波溫度設定70oC微波1min。 54
圖 二十一、BSA DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A）與傳統BSA in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 56
圖 二十二、Lysozyne DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A），與傳統Lysozyme in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 57
圖 二十三、Ovalbumin DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A），與傳統Ovalbumin in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 58
圖 二十四、α-lactobumin DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A），與傳統α-lactobumin in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 59
圖 二十五、β-lactobulin DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A），與傳統β-lactoglobulin in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 60
圖 二十六、ribonuclease DTT微波溫度設定90oC微波1min，IAA溫度設定70oC微波1min（A），與傳統ribonuclease in solution digestion乙醯胺化的結果（B）相互比較結果。 61
圖 二十七、微波爐瓦數設定在1100W，α-lactobumin加入10ul DTT微波5min，加入20ul IAA微波5min乙醯胺化結果經過計算大於其包含cysteine個數。 62
圖 二十八、將α-lactobumin加入DTT及IAA微波時間縮短2~3min或將微波爐瓦數減弱至528瓦加入DTT及IAA微波時間5min。 63
圖 二十九、（A）18O未標定上Lysozyme要觀測的peak（m/z=1753）。 （B）18O標定上Lysozyme要觀測的peak（m/z=1753）。 66
圖 三十、以溫度為變數消化時間均15 min。 67
圖 三十一、聚焦式恆溫微波裝置70oC不同時間下與恆溫槽58o C 消化率之比較。 68
圖 三十二、BSA加入DTT與IAA微波5min，微波消化15min消化率。 70
圖 三十三、Lysozyme加入DTT與IAA微波5min，微波消化15min消化率。 70
圖 三十四、Ovalbumin加入DTT與IAA微波5min，微波消化15min消化率。 71
圖 三十五、α-lactobumin加入DTT與IAA微波1min，微波消化15min消化率。 71
圖 三十六、家用微波爐輔助鑑定出Coomassie blue stain未知樣品一。 73
圖 三十七、家用微波爐輔助鑑定出Coomassie blue stain未知樣品二。 73
圖 三十八、消化溫度為50oC時的消化率。 83
圖 三十九、消化溫度為60oC時的消化率。 83
圖 四十、消化溫度為70oC時的消化率。 83
圖 四十一、消化溫度為80oC時的消化率。 84
圖 四十二、聚焦式恆溫微波裝置微波消化2 min。 84
圖 四十三、聚焦式恆溫微波裝置微波消化4 min。 84
圖 四十四、聚焦式恆溫微波裝置微波消化5 min。 85
圖 四十五、聚焦式恆溫微波裝置微波消化10 min。 85
圖 四十六、聚焦式恆溫微波裝置微波消化15 min。 85
圖 四十七、聚焦式恆溫微波裝置微波消化20 min。 85
圖 四十八、聚焦式恆溫微波裝置微波消化25 min。 86
圖 四十九、聚焦式恆溫微波裝置微波消化30 min。 86

表目錄
表 一以微波時間、溫度為變數Lysozyme乙醯胺化的數目。. 55
表 二 微波輔助與傳統in solution digestion乙醯胺化結果之比較。 64
表 三 聚焦式恆溫微波裝置70oC不同時間下與恆溫槽58o C 消化率之比較。 68
表 四 家用微波爐輔助鑑定出Coomassie blue stain標準品。 74
表 五 家用微波爐輔助鑑定出Coomassie blue stain未知樣品。 75
表 六 家用微波爐輔助鑑定出silver stain標準品。 76
表 七 鑑定出經電擊處理老鼠腦部的蛋白質。 77
表 八 鑑定出服用精神分裂藥物老鼠腦部的蛋白質。 78

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