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我們從土壤中篩選出一株可生產葡萄寡醣氧化繪的霉菌菌株,編號為T1,經過詳細的 菌學鑒定及相關菌種之活性比對,確認其菌名為Acremonium strictum 。T1菌在 皮 培養基中培養5-7 天后,在菌體外液中可測出葡萄寡醣氧化繪的活性。 粗酵素液經由45.-48% 飽和硫酸銨分割沈澱,Fractogel DEAE-650M, Fractogel Ph- enyl-650M,Biogel P100 及Ultrogel hydroxyapaptite等管柱純化后,可獲得均質化 的酵素。比活性由原來的0.004 unit/mg , 提高到2.2 unit/mg ,純度提高550 倍, 回收率21%。 純化之酵素是一種醣蛋白, SDS-PAGE及HPLC分子篩管柱,認為是單一勝踽所構成,分 子量大約是61KDa 左右。含醣量8∼31%。PI在4.2∼4.4之間。純化的酵素帶有黃色, 在274,379 及444mm 等波長處有明顯之吸收峰,而所含flavo特質為FAD , 且1 莫耳的 酵素含有等莫耳FAD 。其a nm lcm吸光值為19.2mM .cm 。 酵素最適反應溫度50℃, 最適反應pH為8-10, 在50℃下維持60分, 仍具有80% 之活性 , 而在pH5 至pH11之間, 酵素相當穩定。本酵素也受1mM Hg 及Fe 離子的完全抑制 , 1mM TNM 化學抑制對酵素有80% 的抑制性。但EDTA,o-phenanthroline及PCMB對酵 素活性影響不大。 本酵素只對葡萄糖、葡萄寡醣、纖維寡醣及乳糖等少數醣類作用,顯示高的基質專一 性,基於對基質的反應性,將此酵素命名為葡萄寡醣氧化繪。酵素對乳糖及纖維二糖 有基質抑制性導致在高、低基質濃度時有不同之反應力,在10mM濃度作用時,麥芽糖 麥芽三糖, 乳糖及纖維二糖及葡萄糖的本對活性為100:94:64:47 59 。但在0.5mM 濃 度作用時,其相對活性分別為15:11:100:120:4 。酵素對纖維二糖、乳糖、麥芽糖及 葡萄糖的Km值分別為0.12、0.38、2.78及23mM。而纖維二糖和乳糖對酵素引起最低基 質制濃度分別為0.1mM 及0.25mM左右。 酵素作用的產物經FT-IR, FAB Mass, H-NMR和 C-NMR 等光譜證實為醛糖酸。經詳細 的計量反應物和產物的變化關系,確定了醣類和O 的消耗及醛醣酸及H O 的生成關系 都是等莫耳變化的。 T 菌經由NTG 誘導結果,篩選出一株命名為T1-38 之變祑株,可穩定的生產大量酵素 ,粗酵素液活性和T1相比, 提高約40倍。T1-38 變祑株的活性也可由液體培養中獲得 ,使用4%蔗糖, 4%脫脂黃豆粉、0.5%NaCl, 0.2%K HPO 及0.02%MgSO ‧7H O(PH6.5) 的培養基,30℃振蕩培養到第5 天時, 有最好的酵素產量。 葡萄寡醣氧經繪在未來的使用上,可開發成澱粉繪及纖維素繪的新型酵素活性測定法 、寡糖類的定量法及生產寡糖酸等方面的應用。 ℃℃℃℃℃℃ ℃℃℃℃℃℃
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