臺灣博碩士論文加值系統

中文摘要
冷凍是一個在生物技術和生藥工業上非常重要的技術，但此技術常影響生化產物之安定性。本研究是為了了解蛋白質在冷凍及回溫過程中性質影響及其機制。利用不同冷凍和回溫的速率及添加其他的生物材料(α-晶體蛋白)方式以了解此過程中蛋白質活性及構型變化及添加物對於蛋白質的保護程度。本實驗利用精胺醯丁二酸裂解酶(hASL)作為實驗材料。精胺醯丁二酸裂解酶是尿素循環的酵素之一，以同質四聚體的方式組成，能將精胺醯丁二酸裂解成精胺酸和反丁醯二酸。α-晶體蛋白則是屬於小熱休克蛋白家族成員之一，具有molecular chaperone-like的功能。利用α-晶體蛋白的特性來探討對精胺醯丁二酸裂解酶的保護作用。利用顯微鏡含冷凍系統(BSC 196)改變精胺醯丁二酸裂解酶冷凍和回溫的速率，設計四個冷凍-回溫的條件：固定冷凍速率在0.8℃/min及改變回溫率速率、固定冷凍速率在60℃/min及改變回溫速率、固定回溫速率在1℃/min及改變冷凍速率、固定回溫速率在15℃/min及改變冷凍速率。另外在冷凍過程中加入α-晶體蛋白和精胺醯丁二酸裂解酶混合，以相同條件進行冷凍及回溫。處理後之蛋白質利用光譜儀進行冷凍前後活性分析，結構則利用分子篩色層分析實驗、色胺酸螢光實驗、圓二色分光光譜儀分析及 Native-PAGE 來分析。在這四個條件下當冷凍和回溫速率都變慢時，會對精胺醯丁二酸裂解酶的活性造成嚴重的下降，精胺醯丁二酸裂解酶的四級結構也有明顯變化，從四聚體變成二聚體。而快速冷凍或回溫精胺醯丁二酸裂解酶的活性及結構沒有明顯變化。加入α-晶體蛋白後，在這四個條件下，無論是在精胺醯丁二酸裂解酶冷凍前或冷凍後，相較於其單獨存在，可以看出於慢速冷凍及回溫下其活性和四聚體結構明顯恢復。利用活性和結構分析方法，顯示冷凍和回溫的速率對於蛋白質的性質有明顯的影響。而α-晶體蛋白可以保護精胺醯丁二酸裂解酶不受冷凍過程造成的傷害及修復其冷凍傷害。

英文摘要
Freezing is a very important operation in the biotechnological and biopharmaceutical industries, but it may result in freezing damage to the bioproducts. In this work, an attempt was made to examine and explain in qualitative and quantitative terms, the effect of freezing and thawing rate on protein damage and to investigate the minimization of protein damage and the additives of α-crystallin during freezing by optimizing the freezing protocols and solution conditions. The result showed that human argininosuccinate lyase (HASL) was highly inactivated during slow freezing and thawing. In the presence of α-crystalin the activity of HASL was protected. No subtle changes in the secondary and tertiary structure of HASL were observed after slow freezing and thawing, but dimers were dissociated from tetrameric HASL. Adding of α-crystalin before or after freezing was able to prevent the disassembly of HASL.

總目錄
目錄 .................................................. II
表目錄 ............................................... VII
圖目錄 ...............................................VIII
名詞縮寫對照表 ...................................... XIII
中文摘要 ............................................. XIV
英文摘要 ............................................. XVI
目錄
序論 ................................................... 1
實驗材料 ............................................... 7
壹、藥品試劑 ....................................... 7
貳、主要儀器及器材 .................................9
參、試劑配置 .......................................10
實驗方法 .............................................. 14
Part I 利用 Surface Plasma Resonance來探討αA 及 αB 晶體蛋白 N 端或 C 端與 HASL 和 δ- 晶體蛋白之交互作用
壹、還原Goose 重組 αB WT DNA .......................14
一、設計引子 ................................... 14
二、DNA 聚合酶連鎖反應 ....................... 15
三、DNA 膠體電泳 ............................. 16
四、回收 DNA .............. .................. 17
五、限制酶(restriction enzyme)切目標DNA和載體 .... 17
六、DNA 黏合反應 (Ligation) ..................... 18
七、轉殖 (transformation) ........................ 18
八、勝任細胞的製備 (Competent Cell, DH5α) 的製備 . 19
九、GC Cloning ................................. 20
貳、構築突變型 Goose 重組 αA DNA、Goose 重組 αB DNA ..22
一、設計引子 ...................................22
二、DNA 聚合酶連鎖反應 ....................... 23
三、DNA 膠體電泳和回收 DNA .................... 24
四、限制酶(restriction enzyme)切目標DNA和載體 .... 24
五、DNA 連結反應 (Ligation) ..................... 25
參、表現 Histag 蛋白質 ............................. 26
肆、純化 Histag 蛋白質 ............................. 27
一、Histag 管柱 ................................27
二、去鹽 ....................................... 28
伍、SDS-PAGE 鑑定蛋白質純度和分子量 ................ 28
一、膠體配置 ...................................28
二. 樣品處理及電泳進行 ......................... 29
Part II 冷凍條件下精胺醯丁二酸裂解酶之安定性及α-晶體蛋白的保護作用
壹、菌體培養 ........................................30
貳、蛋白質純化 ......................................31
一、 hASL 重組蛋白質之純化 ...................... 31
二、 α-crystallin ( α-晶體蛋白 ) 之純化 ........ 33
叁、以 SDS-PAGE 鑑定蛋白質純度和分子量 ............ 34
一、膠體配置 ...................................34
二. 樣品處理及電泳進行 ......................... 35
三、銀染法 ..................................... 35
肆、蛋白質含量測定 ..................................36
伍、蛋白質活性測定 ..................................37
陸、冷凍活性實驗.....................................38
一、製備樣品 ....................................38
二、冷凍實驗流程.................................38
三、測定蛋白質活性...............................39
柒、圓偏振二色旋分析光譜 (Circular Dichroism Spectrophotometer) ............................ 40
捌、螢光光譜實驗 ................................... 41
一、 色胺酸螢光光譜實驗 ......................... 41
二、 ANS 結合實驗 ............................... 42
玖、分子篩色層分析 ................................. 43
拾、Native-PAGE .................................... 43
拾壹、蛋白質聚集散射分析實驗 ........................ 44
結果 .................................................. 46
Part I利用Surface Plasma Resonance 的生物晶片來探討αA, αB 是用 N 端或 C 端跟 HASL 和 δ 鍵結和交互作用
壹、Histag 蛋白質純化 ............................... 46
一、 Histag 管柱 .................................. 46
Part II冷凍條件下精胺醯丁二酸裂解酶之安定性及α-晶體蛋白的保護作用
壹、蛋白質純化 ..................................... 47
貳、冷凍活性實驗 ....,........,... ..,.............. 49
參、圓偏振二色旋光譜分析 ( Circular Dichroism Spectrophotometer ) ............................. 50
肆、螢光光譜實驗 ................................... 51
伍、分子篩色層分析 ................................. 52
陸、Native-PAGE ....................................54
柒、α–crystallin 冷凍前後對 hASL 保護效果的可見光散射情形 ........................................... 55
捌、BSA 和α–crystallin 對 hASL 冷凍保護活性比較 ... 56
玖、運用 Native-PAGE 比較 BSA 和α–crystallin 對 hASL 冷凍保護四級結構之結果 ......................... 56
拾、利用 gel-filtration 和 Native-PAGE 來了解 α–crystallin 和 hASL 作用機制 ................ 57
拾壹、在不同室溫反應時間下α–crystallin 對於冷凍破壞後的 hASL 活性和結構回復情形 ..................... 57
拾貳、冷凍至 -30 ℃ 停留不同時間對於 hASL 的破壞程度 58
討論 .................................................. 59
參考文獻 .............................................. 67
表目錄
表一、冷凍程式 ........................................... 70
表二、 hASL 固定回溫速率在 1 ℃/min 和 15 ℃/min冷凍後之ANS 結合光譜 ........................................ 71
表三、 hASL 固定冷凍速率在 0.8 ℃/min 和 60 ℃/min冷凍後之ANS 結合光譜 .................................... 72
圖目錄
圖一、冷凍顯微鏡系統 ................................... 73
圖二、αA N 端加 Histag 跑完 Histag Column SDS-PAGE 分析 ..74
圖三、將各步驟純化結果進行 hASL SDS-PAGE 分析 ............ 75
圖四、α-crystallin 跑完 S-300 SDS-PAGE 分析 ............76
圖五、冷凍活性圖，固定回溫速率在 1 ℃/min，改變冷凍速率 .. 77
圖六、冷凍活性圖，固定回溫速率在 15 ℃/min，改變冷凍速率 .. 78
圖七、冷凍活性圖，固定冷凍速率在 0.8 ℃/min，改變回溫速率 ..79
圖八、冷凍活性圖，固定冷凍速率在 60 ℃/min，改變回溫速率 .. 80
圖九、單獨 hASL 圓偏振二色旋光光譜分析 .................. 81
圖十、hASL 冷凍後加入 α–crystallin 反應的圓偏振二色旋光光譜分析 ............................................. 82
圖十一、hASL加入 α–crystallin 冷凍反應後之圓偏振二色旋光光譜分析 ......................................... 83
圖十二、固定 hASL 回溫速率在 1 ℃/min 和 15 ℃/min之色胺酸光譜 ............................................ 84
圖十三、hASL 固定冷凍速率在 0.8 ℃/min 和 60 ℃/min冷凍後之色胺酸光譜 ...................................... 85
圖十四、hASL 固定回溫速率在 1 ℃/min 和 15 ℃/min ，冷凍後加
α–crystallin之色胺酸光譜 ........................86
圖十五、hASL 固定冷凍速率在 0.8 ℃/min 和 60 ℃/min ，冷凍後加α–crystallin 之色胺酸光譜 .................... 87
圖十六、hASL 與 α–crystallin，固定回溫速率在 1 ℃/min 和 15 ℃/min 冷凍後之色胺酸光譜 .......................... 88
圖十七、hASL 加α–crystallin，固定冷凍速率在 0.8 ℃/min 和 60 ℃/min 冷凍後之色胺酸光譜 ....................... 89
圖十八、hASL 固定回溫速率在 1 ℃/min 和 15 ℃/min冷凍後之ANS 結合光譜 ...................................... 90
圖十九、hASL 固定冷凍速率在 0.8 ℃/min 和 60 ℃/min冷凍後之ANS 結合光譜 ...................................... 91
圖二十、分子篩層析圖， hASL 冷凍條件為固定回溫速率 1 ℃/min, 改變冷凍速率 ....................................... 92
圖二十一、分子篩層析圖， hASL 冷凍條件為固定回溫速率 15 ℃/min, 改變冷凍速率 ................................. 93
圖二十二、分子篩層析圖， hASL 冷凍條件為固定冷凍速率 0.8 ℃/min, 改變回溫速率 ................................. 94
圖二十三、分子篩層析圖， hASL 冷凍條件為固定冷凍速率 60 ℃/min, 改變回溫速率 ................................. 95
圖二十四、分子篩層析圖， hASL加α–crystallin，於固定回溫速率 1 ℃/min, 改變冷凍速率條件下進行冷凍 ............ 96
圖二十五、分子篩層析圖， hASL加α–crystallin，於固定回溫速率 15 ℃/min, 改變冷凍速率條件下進行冷凍 ........... 97
圖二十六、分子篩層析圖， hASL加α–crystallin，於固定冷凍速率 0.8 ℃/min, 改變回溫速率條件下進行冷凍 .......... 98
圖二十七、分子篩層析圖， hASL加α–crystallin，於固定冷凍速率 60 ℃/min, 改變回溫速率條件下進行冷凍 ........... 99
圖二十八、分子篩層析圖， hASL於固定回溫速率 1 ℃/min, 改變冷凍速率，冷凍後加α–crystallin反應 ............... 100
圖二十九、分子篩層析圖， hASL於固定回溫速率 15 ℃/min, 改變冷凍速率，冷凍後加α–crystallin反應 ............... 101
圖三十、分子篩層析圖， hASL於固定冷凍速率 0.8 ℃/min, 改變回溫速率，冷凍後加α–crystallin反應 .............. 102
圖三十一、分子篩層析圖， hASL於固定冷凍速率 60 ℃/min, 改變回溫速率，冷凍後加α–crystallin反應 ............... 103
圖三十二、 分子篩層析圖，δ-crystallin 於固定冷凍速率 60 ℃/min, 改變回溫速率進行實驗 ........................ 104
圖三十三、Native-PAGE固定回溫速率 1 ℃/min，改變冷凍速率 105
圖三十四、Native-PAGE固定回溫速率 15 ℃/min，改變冷凍速率 106
圖三十五、Native-PAGE固定冷凍速率 0.8 ℃/min，改變回溫速率 ................................................ 107
圖三十六、Native-PAGE固定冷凍速率 60 ℃/min，改變回溫速率 108
圖三十七、55 ℃ 下， α–crystallin 冷凍前後對 hASL 保護效果的可見光散射情形 ............. ..................... 109
圖三十八、BSA 和 α–crystallin 對 hASL 保護作用比較 ....110
圖三十九、運用 Native-PAGE 比較 BSA 和α–crystallin 對 hASL 冷凍保護四級結構之結果 ............................ 111
圖四十、利用gel-filtration 和 Native-PAGE 了解 α–crystallin 和 hASL 作用機制 ................... 112
圖四十一、在室溫不同反應時間下α–crystallin 對於冷凍破壞後的 hASL 活性回復情形 (冷凍速率 0.5 ℃/min , 回溫速率 15 ℃/min ) ........................................... 113
圖四十二、在室溫不同反應時間下α–crystallin 對於冷凍破壞後的 hASL 活性回復情形 (冷凍速率 0.5 ℃/min , 回溫速率 1 ℃/min) ............................................ 114
圖四十三、hASL 單獨存在和加入 α–crystallin 對於冷凍破壞後的 hASL在室溫不同反應時間下結構回復情形 ............115
圖四十四、冷凍至 -30 ℃ 停留不同時間對於 hASL 的破壞程度 116
圖四十五、 hASL溶液在 -25℃～-26℃ 之間形成的再結晶 .... 117
圖四十六、 hASL 溶液在快速冷凍至 -30 ℃ 形成之冰晶圖 ... 118
圖四十七、 hASL 溶液在慢速冷凍形成之冰晶圖 ............. 119
圖四十八、 hASL 溶液在慢速冷凍至 -30 ℃ 時形成之冰晶圖 . 120

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