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研究生:王雲慶
研究生(外文):Yun-Ching Wang
論文名稱:Xanthomonas campestris pv. campestris中受到lexA1與lexA2調控之基因之探討
論文名稱(外文):Characterization of the Xanthomonas campestris pv. campestris lexA1 and lexA2 Regulons
指導教授:楊明德楊明德引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:分子生物學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:115
中文關鍵詞:十字花科黑腐病菌、緊急求救反應、lexA1、lexA2、recA
外文關鍵詞:Xanthomonas campestris、SOS response、lexA1、lexA2、recA
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本實驗室在Xanthomonas campestris pv. campestris strain 17 (Xc17)中,發現具有兩套lexA基因,分別命名為lexA1及lexA2,而利用LexA1 Box進行X. campestris基因庫序列的搜尋,在umuDC基因上游有一段吻合的序列,可能受LexA1調控,因此本研究以南方墨點法分析十株不同的Xanthomonas菌株後,確定umuDC僅存在於X. campestris pv. campestris ATCC33913中,此外經由UV敏感性測試及umuD啟動子活性測試,證明umuD基因會受到LexA1的正調控。同樣利用南方墨點法分析十株不同的Xanthomonas菌株後,發現這些菌株都具有兩套lexA基因,為了探討這兩套lexA基因及recA基因在Xanthomonas菌株的調控關係及在SOS反應中所扮演的角色,本研究中構築了lexA1突變株 (XDA1) 及利用先前實驗室已構築之lexA2突變株 (XDA2) 與recA突變株 (NT3) 進行探討。先測試其生長曲線無明顯差異後,再經由UV敏感性測試證明在UV劑量300 J/m2照射下,這三株突變株與Xc17野生株相較起來,XDA1及XDA2存活率分別下降了約220及200倍,而NT3存活率約下降了3370倍,顯見lexA1、lexA2及recA基因對菌體遭受到DNA傷害時的重要性。由於Xc17菌株的lexA1基因下游存在著recA及recX基因,測試三者之啟動子片段的表現活性,確定僅有lexA1及recA啟動子可受mitomycin C (MMC) 誘導而大量表現,而recX啟動子片段則完全不表現。而在lexA2基因的下游則是存在著sulA2、dinP2及dnaE2,同樣測試這四個啟動子片段的表現活性,發現只有lexA2啟動子是可被MMC誘導而提高表現量,dinP2啟動子僅有微量的表現,而sulA2及dnaE2則是完全不表現。所以藉由北方墨點法及反轉錄聚合酶連鎖反應,確認lexA1及lexA2基因可能藉由lexA1-recA-recX及lexA2-sulA2-dinP2-dnaE2以形成operon的方式共同表現來帶動下游的基因,藉此方式來調控下游基因的表現。而利用lacZ報導基因進行lexA1、lexA2及recA啟動子之活性測試,發現在受到MMC 誘導後的不同時間點,這三個啟動子皆能隨著時間的增加而提高表現比值;在誘導3小時後,recA啟動子有3.5倍的增加,而lexA1與lexA2的誘導比值約在1.1 ~ 1.4倍,確定最先啟動的是recA啟動子。由於整個SOS反應中最重要的基因為recA,因此利用Tn5跳躍子隨機破壞造成突變,篩選能影響recA啟動子活性之菌落。目前已從篩選出的11顆突變株中,確認出Tn5是分別破壞了recD、recC及piuB基因,而與recA基因之關係,仍有待進一步探討。
Two lexA genes, named lexA1 and lexA2, had been identified in Xanthomonas campestris pv. campestris strain 17 (Xc17) in our previously studies. Computational search for genes possibly regulated by LexA1 and LexA2 proteins in the available genomic sequence of the X. campestris showed that the sequence in the upstream region of umuDC gene has an identical LexA1 binding motif. Southern blot analysis revealed that umuDC gene only exists in X. campestris ATCC33913 among the ten Xanthomonas strains studied. UmuD gene was demonstrated to be positively regulated by LexA1 protein using UV sensitivity test and promoter activity assay. To elucidate the regulatory mechanisms of the two lexA genes and recA in SOS response in the ten Xanthomonas strains, a currently constructed lexA1 mutant strain (XDA1) and previous constructed lexA2 mutant strain (XDA2) and recA mutant strain (NT3) were used in this study. Growth curves showed no difference among mutants and wild type strains. The XDA1, XDA2 and NT3 mutant strains were found to be UV sensitive because an exposure to 300 J/m2 UV irradiation resulted in respective 220, 200 and 3370-fold decrease in survival rate. LexA1, lexA2 and recA genes should have their importance when DNA was damaged. Because the recA and recX genes are located just downstream of lexA1 in Xc17, the promoter activities of lexA1, recA, and recX were determined. The results indicated that the lexA1 and recA promoters were induced by MMC but recX was not. On the other hand, it has been shown that sulA2, dinP2, and dnaE2 genes were located just downstream of the lexA2 gene. Promoter activity assay indicated that the lexA2 was induced by MMC and dinP2 was slightly induced but sulA2 and dnaE2 were not. Northern blot analysis and RT-PCR indicated that the two lexA genes could be regulated to form operons lexA1-recA-recX and lexA2-sulA2-dinP2-dnaE2 for downstream gene expression. By using the lacZ as a reporter gene to measure the promoter activity of lexA1, lexA2 and recA, the transcriptional activities of these promoters were enhanced by MMC and the induction was time-dependent. After inducing for 3 hours, the recA increased 3.5-fold but the ratio of lexA1 and lexA2 was 1.1~1.4-fold, indicating that the recA promoter was the first target among these three promoters. Because recA is the most important gene in SOS response, the genes affecting recA expression were investigated by Tn5 mutagenesis. To date, recD, recC and piuB mutants were confirmed to be three of the mutagenesis colonies and waited for further studies of the relationship between piuB, recD, recC and recA.
縮寫字對照表••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
中文摘要••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
英文摘要••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
前言•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6
材料與方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
I. 材料•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
一、 菌種與質體•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
二、 藥品••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
三、 酵素••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
四、 培養基與緩衝溶液••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16
五、 引子••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16
II. 實驗方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
一、 細菌之培養•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
二、 勝任細胞 (Competent cell) 之製備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
三、 轉形作用 (Transformation)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
四、 接合作用 (Conjugation) 與跳躍子 (miniTn5-Tc) 致突變法•••••••••• 18
五、 溶菌斑點測試 (Spot test)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
六、 菌種保存法 (Stock)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
七、 生長曲線測試•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
八、 UV 敏感性測試••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
九、 染色體 DNA 之抽取••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
十、 小量質體DNA 之抽取••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
十一、 CsCl 梯度離心抽取大量質體DNA•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
十二、 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reation;PCR)••••••••••••••••••• 21
十三、 限制酶切割分析 (Restriction enzyme digestion)••••••••••••••••••••••• 21
十四、 洋菜膠體電泳分析 (Agarose gel electrophoresis)••••••••••••••••••••• 22
十五、 DNA 片段回收••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
十六、 DNA 黏合反應 (Ligation)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 23
十七、 DNA 定序分析 (DNA sequencing)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 23
十八、 南方墨點法 (Southern blot)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
十九、 β-galactosidase 活性分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25
二十、 總體RNA 之抽取•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
二十一、 引子延伸法 (Primer extension) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
二十二、 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
二十三、 北方墨點法 (Northern blot)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
二十四、 蛋白質凝膠電泳分析 (SDS-PAGE)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
二十五、 西方墨點法 (Western blot)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
二十六、 二維電泳分析 (Two dimensional gel electrophoresis)••••••••••• 30
二十七、 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF) 及液相
層析/串聯式質譜儀 (LC-MS/MS) 分析之前處理•••••••••••••••••••••••••••••••••••31
結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33
一、 lexA1、lexA2 及umuDC基因在Xanthomonas 中的分佈•••••••••••••••33
1. 十株Xanthomonas 菌株中lexA1 基因之分佈•••••••••••••••••••••••••••••••••33
2. 十株Xanthomonas 菌株中lexA2 基因之分佈•••••••••••••••••••••••••••••••••34
3. 十株Xanthomonas 菌株中umuDC 基因之分佈••••••••••••••••••••••••••••••34
二、 構築Xc17 lexA1 基因突變株•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
1.質體pKO3-NGC 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
2. XDA1 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
三、 構築ATCC33913 umuDC 基因突變株•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36
1. 質體pOK12-DGC 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37
2. X913DC (umuD- umuC-) 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37
3. 南方墨點法分析X913DC (umuD- umuC-)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37
四、 Xc17、ATCC33913 野生株及各突變株之生長曲線••••••••••••••••••••••••38
1. 野生株Xc17、突變株XDA1、XDA2及NT3 之生長曲線•••••••••••••••••••••38
2. 野生株Xc17、ATCC33913、突變株X913DC 及X913C 之生長曲線••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••39
五、 不同菌株之UV 敏感性測試•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••39
1. Xc17、ATCC33913、Xci60、X913DC 及X913C 之UV 敏感性測
試••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••40
2. 質體pBK-umuDC 之構築•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••40
3. ATCC33913、突變株X913DC 及以不同濃度阿拉伯醣誘導之互補
株X913DC (pBK-umuDC) 之UV 敏感性測試••••••••••••••••••••••••••••••••••••••40
4. Xc17、ATCC33913 及Xc17 (pBK-umuDC) 之UV 敏感性測試••••••••41
5. Xc17、XDA1、XDA2 及NT3 之UV敏感性測試•••••••••••••••••••••••••••••••••41
6. 質體pBK-recA 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••41
7. 互補株XDA1 (pBK-pET2846)、XDA2 (pBK-pET5360) 及NT3
(pBK-recA) 之UV 敏感性測試•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
六、 umuDC 基因在不同菌種中之表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
1. 質體pFY-PumuD 及pFY-PEumuD 之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
2. 利用lacZ 報導基因之表現來偵測umuD 啟動子表現•••••••••••••••••••••••42
七、 利用二維電泳偵測LexA1 蛋白調控之基因••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
1. 二維電泳分析Xc17 及XDA1 之總蛋白•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
2. MALDI-TOF 及LC-MS/MS 分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
八、 探討lexA1 及lexA2 cassette 在不同菌株之表現••••••••••••••••••••••••• 44
1. 質體pFY-PrecX、pFY-P5361、pFY-P5362 及pFY-PdnaE2 之構築••44
2. 利用lacZ 報導基因來偵測lexA1 及lexA2 cassette 中各啟動子片段
受MMC 誘導後之表現活性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44
3. 北方墨點法分析lexA1 cassette••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45
4. 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 分析lexA1 cassette•••••••••••••••••••46
5. 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 分析lexA2 cassette•••••••••••••••••••46
6. 利用 lacZ 報導基因之表現來偵測 lexA1、lexA2 及recA 啟動子片
段在不同菌株經由 MMC 誘導不同時間點之活性•••••••••••••••••••••••••••••••••46
九、 篩選可調控recA 啟動子表現之基因••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••48
1. 質體pOK-PZGP之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••48
2. 轉殖株XPAZ (PrecA::lacZ)之構築••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••48
3. 南方墨點法分析XPAZ (PrecA::lacZ) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••49
4. 以接合方式 (conjugation) 篩選可調控recA 啟動子表現之突變株•••49
5. φL7 溶菌斑點測試XPAZ::Tn5 突變株••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••50
6. 利用lacZ 報導基因在MMC 誘導後之表現活性來分析XPAZ::Tn5
突變株•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••50
7. 分析XPAZ::Tn5 突變株之染色體受miniTn5-Tc 嵌入處之序列••••••••50
討論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 52
一、 Xc17 的兩套lexA 基因••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 52
二、 umuDC 存在與否及其功能探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 53
三、 lexA1、lexA2、recA 之重要性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55
四、 lexA1 及lexA2 所調控的基因•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55
參考文獻••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 58
圖表•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 68
附錄•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 104
廖怡雯 (2005) 十字花科黑腐病菌緊急求救反應之探討。國立中興大學分子生物
學研究所碩士論文。
鄭巧蕾 (2003) 十字花科黑腐病菌兩套lexA 基因之功能與研究分析。國立中興大
學分子生物學研究所碩士論文。
李馥君 (2003) 利用luxAB 報導基因探討Xanthomonas campestris pv. campestris
緊急求救反應之調控機制。國立中興大學分子生物學研究所碩士論文。
張瑜鳳 (2002) 線狀噬菌體 φLf 之感染需要宿主之 pilL 基因參與。國立中興大
學分子生物學研究所碩士論文。
吳順吉 (2002) Xanthomonas campestris pv. campestris engXCA 基因之轉錄調控。
國立中興大學分子生物學研究所碩士論文。
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