臺灣博碩士論文加值系統

抗生素尚未被發現之前，感染細菌型腦膜炎的病人致死率是相當的高的，但是一旦受到感染，初期出現的外顯的病徵並不明顯，主要會出現頭痛、發燒、頸椎僵直等症狀，更嚴重的才會出現神智不清的情形。所以沒有辦法有效的從外在的病徵去判斷病人是否感染腦膜炎。
由於感染的部位是在腦脊髓液的部分，所以當醫生判定懷疑是感染腦膜炎之後，必須要進行脊椎穿刺然後抽取病人的腦脊髓液來進行進一步的診斷，腦脊髓液需要一天的時間進行細菌培養，另外需要一天進行抗藥性紙錠試驗。但是腦膜炎發病速度快，所以罹患腦膜炎的病人需要立刻接受抗生素的治療，如果沒辦法馬上確定感染的細菌菌種，醫生便只能先給予廣效性的抗生素，在確定致病菌之後才能針對細菌給予正確的藥物，所以如何快速診斷並且偵測致病菌和其抗藥性是有急迫性的。
拉曼光譜在傳統材料與化學分子的鑑定和分析已經行之有年，散射的光譜具有分子指紋(Fingerprint)的特性，但是因為拉曼光譜的訊號微弱，不適合用來長時間的偵測生物性的樣本，一直到近年來表面增強拉曼散射光譜(Surface Enhanced Raman Scattering)技術相對成熟，拉曼散射的訊號得以大量提升，所以偵測的時間得以大幅度的縮短，因此許多科學家認為此技術現在對於生物性樣本的診斷與偵測具有高度潛力。
本研究針對細菌型腦膜炎的常見十種致病菌進行表面增強拉曼散射光譜的偵測，偵測結果將會統整成一個小型的資料庫以利分類，並且利用生物常用的方式和物理方法進一步濃縮並收集腦脊髓液的中的細菌，以利進一步的偵測。
結果發現，不同細菌的光譜各自具有代表性，可以藉由已知的細菌光譜資料庫來進行比對，另外利用過濾膜可以回收腦脊髓液中的致病菌，以利進行細菌光譜的偵測。

Before the discovery of antibiotic, meningitis was a fatal disease. At the beginning of the infection, the symptoms of meningitis are hard to differentiate from other illnesses. Besides, it takes about 2~3 days to culture and diagnosis the pathogen after acquisition of the Cerebrospinal fluid(CSF) from patient. It is fatal for the patients if appropriate antibiotics are not prescribes soon after infection, therefore, it is of utmost important to identify the pathogen as quickly as possible.
Raman Scattering was discovered in 1928, it has been used to analyze pure chemical elements. The spectrum can represent the specific chemical bond. Since the signal of Raman Scattering is quite weak, and is not appropriate to apply to biological samples. After the discovery of the technique of Surface Enhanced Raman Scattering(SERS). The Raman Scattering signal has now been applied to biological samples.
This research focus on the 10 pathogens of bacterial meningitis, and two methods including Flow Cytometry and Filter are used to differentiate the bacteria in the CSF from patients. The result shows the spectrum of different bacteria is specific, and after filtration we are able to isolate the bacteria from CSF, which will be detected by SERS spectrometer.

致謝 i
中文摘要 ii
Abstract iii
目錄 iv
第一章 研究背景 1
1.1 細菌型腦膜炎背景介紹 1
1.1.1 細菌型腦膜炎致病菌 1
1.1.2 細菌性腦膜炎的診斷 1
1.1.3 細菌性腦膜炎的治療 2
1.2 拉曼散射 3
1.2.1 拉曼散射發展歷史 3
1.2.2 拉曼散射原理 3
1.2.3 拉曼光譜 4
1.3 表面增強拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering) 4
1.3.1 表面增強拉曼散射歷史 4
1.3.2 表面增強拉曼散射原理 4
1.3.3 表面增強拉曼散射強度 4
1.3.4 表面增強拉曼散射應用 5
1.3.5 表面增強拉曼散射光譜之處理 5
第二章 材料方法 6
2.1細菌菌株 6
2.2細菌進行SERS光譜偵測前處理 6
2.3腦脊髓液之SERS光譜對細菌之干擾 7
2.4細菌利用Baclight染色 8
2.5利用5μm和0.22μm的Filter回收並且濃縮細菌 10
第三章 研究結果 12
3.1革蘭氏陽性菌與陰性菌之ATCC標準菌SERS光譜比較 12
3.2革蘭氏陽性與陰性臨床菌和其ATCC標準菌SERS光譜比較 12
3.3利用LDA(Linear Discriminant Analysi)分析光譜結果 13
3.4細菌光譜利用SVM(Support Vector Machine)分析結果 14
3.5腦脊髓液(CSF)的光譜與細菌光譜之比較 15
3.6利用細胞分選儀(Flow Sorter)分離菌體 15
3.7細菌利用5μm和0.22μm Filter回收濃縮 16
第四章 討論 17
4.1建立快速偵測細菌性腦膜炎致病菌診斷平台之重要性 17
4.2細菌的表面增強拉曼光譜之準確性 17
4.3流行性感冒嗜血桿菌和陽性菌光譜相似 18
4.4抗藥性菌株的進一步實驗 18
4.5檢體中的細菌 18
第五章 參考資料 20
第六章 圖表 21
圖1、入射光激發電子的虛擬能階示意圖 21
圖2、由膠體銀吸附在細菌上所得到的SERS光譜 22
圖3、奈米銀粒子與在顯微鏡下觀察方式 23
圖4、細菌光譜再現性與穩定性 24
圖5、表面拉曼散射光譜處理步驟 25
圖6、Gram positive bactiria 26
圖7、Gram Negative bacteria 27
圖8、Staphylococcus aureus 28
圖9、Streptococcus agalactiae 29
圖10、Streptococcus pneumoniae 30
圖11、Listeria Monocytogenesis 31
圖12、Klebsiella pneumoniae 32
圖13、Escherichia coli 33
圖14、Acinetobacter baumannii 34
圖15、Pseudomonas aeruginosae 35
圖16、Haemophilus influenzae 36
圖17、Neisseria meningitides 37
圖18、LDA(Linear Discriminant Analysis) 38
圖19、Linear Discriminant Analysis of meningitis samples 39
圖20、LDA of Gram positive bacteria and Hemophilus influenzae 40
圖21、SVM(Support Vector Machine) 41
圖22、腦脊髓液(CSF)的光譜與細菌光譜之比較 42
圖23、腦脊髓液(CSF)之SERS光譜 43
圖24、E. Coli 利用Baclight染色並且利用共軛焦顯微鏡確認染色狀況 44
圖25、E. Coli 利用Baclight染色並且利用Flow cytometry確認染色狀況 45
圖26、E. Coli利用Baclight sorting結果 46
圖27、5μm和0. 22μm filter示意圖 47
圖28、濃度106CUF/ml金黃色葡萄球菌通過filter前後的光譜比較 48
表一、本研究所使用之ATCC標準菌菌株 49
表二、本研究所使用之臨床細菌菌株數量 50
表三、各個菌種的光譜數量 51
表四、5-fold cross validation accuracy of meningitis samples 51
表五、革蘭氏陽性菌與流行性感冒嗜血桿菌用SVM可分辨比例 52
表六、利用5-fold cross validation區分革蘭氏陽性菌與流行性感冒嗜血桿菌的結果 52
表七、E. Coli利用Baclight sorting結果回收成果 53
表八、細菌透過兩個filter之後的回收率 54

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