臺灣博碩士論文加值系統

KNOX（knotted 1-like homeobox）基因控制植物許多生長發育的過程，包括莖頂分生組織，葉片和花朵發育，而KNAT3基因屬於KNOX Ⅱ。本實驗自朵麗蝶蘭Dtps. Sogo Vivien花序中抽取RNA，利用RT-PCR得到KNAT3 cDNA全長，其胺基酸序列和阿拉伯芥KNAT3基因相似度達81％。在型態上，三唇瓣株於0.3 cm 花苞時期可於翼瓣尖端觀察到缺刻產生，突變株苞片會較正常株大且有色素著生。利用RT-PCR分析全開花、葉和根的表現量，整體正常株和三唇瓣的表現相似，皆在根的表現量較低。正常株之各時期表現量呈現遞增的趨勢，而三唇瓣株則以0.8-0.99 cm時期表現量最高。分析正常株和三唇瓣花苞各部位之表現除花粉塊表現量明顯較低外，其他部位皆有明顯的表現。觀察0.2和0.3 cm花苞時期各部位表現量，0.3 cm花苞整體表現明顯較0.2 cm花苞高，與缺刻發生時期吻合。選殖出之Phal. KNAT3啟動子，含有光反應，荷爾蒙作用和逆境相關之順勢調節子。

中文摘要 I
ABSTRACT II
誌謝 III
目錄 IV
圖表目錄 IX
壹、前言 1
貳、前人研究 2
一、蝴蝶蘭與朵麗蝶蘭之簡介及分類地位 2
二、蝴蝶蘭與朵麗蝶蘭之花朵發育 2
三、植株莖頂 4
四、KNOX基因與莖頂分生組織的調控 4
五、KNOX基因對營養生長和生殖生長的影響 6
（一）KNOX在莖頂分生組織發育的表現與調控 6
（二）KNOX基因在葉片發育上的調控 8
（三）KNOX基因在花器發育上的功能 9
六、影響KNOX基因表達的因子 11
（一）基因的調控 11
1. MYB基因家族 11
2. 其他調控基因 12
（二）植物生長激素的影響 13
参、材料與方法 15
一、試驗材料 15
二、試驗方法 15
（一）植株形態觀察 15
（二）植物總量RNA萃取 15
（三）KNAT3基因序列分析 16
1. 胺基酸序列相似性之比較（BLAST analysis of NCBI） 16
2. KNAT3胺基酸多序列比對和親緣圖之繪製（Alignments and trees of CLC） 16
3. 親疏水性分析（Hydropathic profile and protein analysis of CLC） 17
4. conserved domain 和motif位置（Blast analysis of NCBI and protein analysis of CLC） 17
5. MicroRNA 作用序列和位置 17
6. 啟動子順式作用片段分析 17
（四）反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR） 17
（五）RT-PCR之南方墨點分析（Southern blot analysis） 18
1. DNA轉漬和固定 18
2. 探針製備 19
3. 雜合反應 19
4. 免疫反應偵測 20
（六）蝴蝶蘭KNAT3基因啟動子的選殖 20
1. 蝴蝶蘭Genome Walker基因庫的建立 20
2. PCR-based DNA walking in Genome Walker Libraries 21
（七）農桿菌轉殖菸草、阿拉伯芥 22
1. 載體構築 22
2. 農桿菌媒介之菸草轉殖 22
3. 農桿菌媒介之阿拉伯芥轉殖 23
4. GUS活性之組織化學染色法鑑定轉殖株 23
5. 以PCR鑑定轉殖株 23
（八）基因槍轉殖蝴蝶蘭 24
1. 材料準備 24
2. 基因槍系統 24
3. 射擊粒子的製備與DNA包覆（coating） 24
4. 基因槍之操作 25
肆、結果 26
一、野生型與突變種植株形態比較 26
二、KNAT3基因序列分析 27
三、KNAT3基因之表現量分析 27
（一）組織各部位表現量分析 27
（二）花各時期表現量分析 27
（三）花瓣各部位表現量分析 28
（四）轉植植株PCR確認和形態觀察 28
四、朵麗蝶蘭KNAT3啟動子構造與結構功能預測 28
伍、討論 30
一、野生型與突變種植株型態 30
二、KNAT3基因序列分析 31
三、朵麗蝶蘭與蝴蝶蘭KNAT3基因之表現分析 32
（一）組織各部位表現量分析 32
（二）花各時期表現量分析 32
（三）花瓣各部位表現量分析 32
四、KNAT3啟動子之順勢作用片段功能分析 33
陸、結論 34
參考文獻 54
附錄 69
作者簡介 73

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