臺灣博碩士論文加值系統

Xanthomonas campestris pv. campestris（Xcc）是引起十字花科植物產生黑腐病的病原菌。此疾病會促進葉片變黃、凋謝和壞死，造成農作物嚴重損失。為探討 Xcc 中的功能性基因，本實驗利用 mini-Tn5 transposon獲得許多突變株，利用抗生素進行篩選，再將抗藥性有差異性的 cloning 進行核酸定序確認基因。 TypA，也稱為 BipA ，為核糖體結合 GTPase 超家族中屬於 TRAFAC 類 GTPase。GTPase 參與多種細胞調節的過程，且在轉譯、核糖體合成及組成、tRNA的修飾、蛋白質轉運、細胞極性化、細胞分裂和信號傳遞發揮重要的作用。TypA在細菌中具高度守恆且序列相似性類似於其他延伸因子，如延伸因子G。 但是 TypA 的確切功能仍了解甚少。 為了探討 typA 基因在 Xc17 中的功能性，我們將 typA基因利用 insertional mutation進行突變，構築 typA 突變株 (Xc17typA::Gm)。我們發現，TypA 蛋白可能對於抗生素的抗性扮演活化因子的角色，幫助活化 bla 產生 β-lactamase 產生。當 typA 突變後，對宿主致病能力下降，但在影響致病能力-運動性上，typA突變株泳動能力卻比野生株好。在特定壓力，如低溫、低 pH 值、SDS、NaCl 中生存是必須的。

Abstract 1
摘要 2
壹、前言 3
貳、文獻回顧 5
參、實驗動機 15
肆、材料與方法 16
一、材料 16
（一）菌株、質體、引子 16
（二）藥品 16
（三）培養基 16
（四）抗生素與其他藥品使用濃度 17
（五）試劑與緩衝溶液 18
二、方法 19
（一）細菌的培養與保存 19
（二）質體DNA之抽取 20
（三）聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction，PCR） 20
（四）洋菜膠體電泳分析（Agarose gel electrophoresis） 21
（五）質體的選殖（Coloning） 22
（六）勝任細胞之製備（Competent cell） 22
（七）轉形作用（Transformation） 23
（八）溶菌斑測試法（Spot test） 24
（九）最低抑菌濃度測試（Minimum Inhibitory Cocentration） 24
（十）β-galacotosidase 啟動子活性 25
（十一）β-lactamase 活性 26
（十二）病原性測試（Pathogenecity） 26
（十三）運動性測試（mobility test） 26

（十四）生長曲線（Growth curve） 27
（十五）逆境測試（Stress test） 27
（十六）胞外酵素（Extracellular enzyme） 27
伍、結果與討論 30
探討 Xcc 中 typA 基因的特性分析 30
（一） typA 基因之分析 30
1、typA 突變株之構築 30
2、typA 互補株之構築 31
（二） 最低抑菌濃度測試結果（MIC） 31
（三）β-lactamase activities 活性測試 32
（四） TypA 參與 bla、ampR、ampG、ampD2、nagZ、typA 基因表現調控測試 33
1、typA啟動子之構築 34
2、bla 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 34
3、ampR 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 35
4、ampG 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 36
5、ampD2 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 36
6、nagZ 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 37
7、typA 啟動子在 Xc 與 typA mutant 活性分析 38
（五）病原性測試 39
（六）胞外酵素測試 39
（七）生長曲線測定 40
（八）運動性分析 41
（九）逆境測試 41
陸、討論 47
柒、表 51
Table 1、本論文使用之菌株 52
Table 2、本論文使用之載體與質體 52
Table 3、本論文使用之引子 54
Table 4、本論文使用之噬菌體 54
Table 5、延伸因子家族結構 domain 比較表 54
Table 6、bla 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 55
Table 7、ampR 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 55
Table 8、ampG 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 56
Table 9、ampD2 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 56
Table 10、nagZ 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 57
Table 11、typA 啟動子在有無誘導物時，Xc17 和 typA突變株之活性 57
Table 12、最低抑菌濃度測定（MIC） 58
Table 13、Xc17 和 typA突變株、typA互補株之 β-lactamase 活性 59
Table 14、Xc17 系列致病性感染測試共20次統計分析結果 60
Table 15、Xc17 系列胞外酵素統計分析 61
捌、圖 62
Fig 1、TypA 結構 domain 示意圖 62
Fig 2、pBBtypA 之構築 62
Fig 3、typA 突變株之構築 63
Fig 4、typA 互補株之構築 64
Fig 5、typA 啟動子之構築 65
Fig 6、 Xc17 與 typA 突變株、typA 互補株 β-lactamase 的活性 （A）no inducer （B）Add 25μg/ml Ampencillin 66
Fig 7、 bla 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 67
Fig 8、 ampR 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 68
Fig 9、 ampG 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 69
Fig 10、 ampD2 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 70
Fig 11、 nagZ 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 71
Fig 12、 typA 啟動子在 Xc17 與 typA 突變株β-galacotosidase 的活性 （A）生長曲線 （B）啟動子活性 72
Fig 13、Xc17 系列致病性感染測試 73
Fig 14、Xc17 系列plate 運動性測試 74
Fig 15、Xc17 系列小空瓶運動性測試 75
Fig 16、Xc17 系列生長曲線測試 76
Fig 17、Xc17 系列胞外酵素分泌測試 77
Fig 18、Xc17 系列逆境測試 – pH值 78
Fig 19、Xc17 系列逆境測試 – NaCl 79
Fig 20、Xc17 系列逆境測試 – CPZ抗生素 80
Fig 21、Xc17 系列逆境測試 – SDS 81
Fig 22、 Xc17 系列逆境測試 – 溫度 82
玖、參考文獻 83

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