臺灣博碩士論文加值系統

日本腦炎病毒屬於黃病毒科黃病毒屬的單股正向RNA病毒，引起急性腦炎，以及永久性神經後遺症。除施打疫苗之外，無有效治療手段。喹唑啉衍生物(Quinazolinone derivatives, QD)具有抗瘧疾、抗發炎、抗細菌以及抗腫瘤的功效。本論文探討13種新穎喹唑啉衍生物抗日本腦炎病毒的功效與機制。藉由細胞存活率、細胞病變抑制、細胞凋亡抑制、病毒斑減少、病毒貼附、報導基因、病毒顆粒活性以及病毒貼附等方法測試喹唑啉衍生物抗日本腦炎病毒效果及路徑。病毒量MOI為0.5的感染條件下，QD52、QD56、QD57、QD58從13個喹唑啉衍生物中篩選出具有抑制日本腦炎病毒感染細胞之CPE且對細胞較無毒性的藥物。QD52、QD56、QD57、QD58之50%細胞毒殺劑量分別為71.37μM 、41.31μM 、大於100μM 、70μM。QD52、QD56、QD57、QD58有濃度依賴性抑制日本腦炎病毒感染之細胞病變及細胞凋亡，在20μM濃度下抑制日本腦炎病毒感染細胞的上清液之病毒產量力價，分別為91.9%、96.1 %、57.66 % 、86.86 %。QD52、QD56、QD57、QD58抑制日本腦炎病毒斑點之50%抑制劑量(IC50)數據分別為28.65μM、17.54μM、46.4μM 、45.76μM。此4種喹唑啉衍生物均不影響病毒貼覆進入細胞。此外，QD52具有細胞外毒殺病毒的效果，而QD56會隨濃度提活化IRF-3路徑，增加IRF-3磷酸化。

Japanese encephalitis virus (JEV) is a mosquito-borne flavivirus with a positive-sense single-stranded RNA genome, causing encephalitis with permanent neurological sequelae in Asia. Currently, there is no effective cure except vaccination. Quinazolinone derivatives(QD) have anti-malarial, anti-inflammatory, anti-bacterial and anti-tumor activities. The aim of this study is to discover antiviral activity of novel QDs against JEV in vitro using the assays ofcytopathic effectinhibition, apoptosis with propidiumiodide(PI) stain, plaque reduction, reporter assay, virus attachment, virucidal activity, and Western blotting. Of 13 QDs, QD52, QD56, QD57, and QD58 significantly inhibited cytopathic effect (CPE) of JEV infected cells with a MOI of 0.5. The 50% cytotoxic concentration (CC50) values of QD52, QD56, QD57, and QD58were71.37μM, 41.31μM, more than 100μM and 70μM, respectively. QD52, QD56, QD57, and QD58 dose-dependently inhibited viral CPE, apoptosis and virus yields. The 50% inhibitory concentration (IC50) values of QD52, QD56, QD57, and QD58 for plaque reduction were28.65 μM, 17.54 μM, 46.4 μM, and 45.76μM, respectively. These four QDs did not block virus attachment. QD52 had a virucidal activity in dose-dependent manners. QD56 activated IRF-3 signaling pathway via the increase of IRF-3 phosphorylation.

目錄
第一章、前言 1
第一節、研究背景 1
一、日本腦炎 1
二、日本腦炎流行病學 3
三、日本腦炎臨床症狀 3
四、日本腦炎治療與疫苗 5
五、喹唑啉(Quinazoline)衍生物: 6
六、實驗動機 7
七、實驗目的 8
第二章、實驗設計與材料方法 8
第一節、實驗設計 8
一、抗病毒活性試驗 8
二、抗病毒機制探討 9
第二節、實驗材料 10
一、細胞株 10
二、病毒株 11
三、抗體 11
四、儀器 12
第三節、實驗方法 12
一、細胞存活率試驗(MTT assay) 12
二、細胞病變抑制試驗(Cytopathic effect inhibition assay) 13
三、流式細胞儀細胞週期染色(Flow cytometry propidiumiodide(PI)stain) 13
四、病毒斑試驗(plaque assay) 14
五、報導基因試驗(reporter assay) 14
六、病毒貼附試驗(virus attachment assay) 15
七、病毒顆粒活性抑制試驗(virucidal activity assay) 16
八、細胞半有效濃度試驗(inhibition concentration，IC50) 16
九、免疫螢光染色(Immuno-fluorescence analysis) 17
十、細胞蛋白萃取(Cell extraction) 18
十一、蛋白質電泳(SDS-PAGE) 18
十二、蛋白質轉印(Transfer) 19
十三、西方墨點法(Wetern blotting) 19
第三章、實驗結果 20
第一節、喹唑啉衍生物之細胞毒性 20
第三節、對日本腦炎病毒的毒殺作用 22
第四節、抑制病毒貼附之功效 22
第五節、對活化IRF-3路徑之能力 23
第六節、確認對IRF-3之調控機制 23
第四章、結論 24
圖目錄
圖一. 細胞病變抑制試驗篩選抗日本腦炎病毒之喹唑啉衍生物QD51、QD52、QD54 25
圖二. 細胞病變抑制試驗篩選抗日本腦炎病毒之喹唑啉衍生物QD56、QD57、QD58 26
圖三. 細胞病變抑制試驗篩選抗日本腦炎病毒之喹唑啉衍生物QD60、QD62、QD63 27
圖四. 細胞病變抑制試驗篩選抗日本腦炎病毒之喹唑啉衍生物QD64 28
圖五.QD52對BHK-21細胞之細胞存活率試驗 29
圖六.QD56對BHK-21細胞之細胞存活率試驗 30
圖七. QD57對BHK-21細胞之細胞存活率試驗 31
圖八.QD58對BHK-21細胞之細胞存活率試驗 32
圖九. QD52對JEV感染細胞之病變抑制 33
圖十. QD56對JEV感染細胞之病變抑制 34
圖十一. QD57對JEV感染細胞之病變抑制 35
圖十二. QD58對JEV感染細胞之病變抑制 36
圖十三. 流式細胞儀分析QD52抑制日本腦炎細胞凋亡之功效 37
圖十四. 流式細胞儀分析QD56抑制日本腦炎細胞凋亡之功效 38
圖十五. 流式細胞儀分析QD57抑制日本腦炎細胞凋亡之功效 39
圖十六.流式細胞儀分析QD58抑制日本腦炎細胞凋亡之功效 40
圖十七. QD52對日本腦炎病毒斑點抑制之50%有效劑量 41
圖十八. QD56對日本腦炎病毒斑點抑制之50%有效劑量 42
圖十九. QD57對日本腦炎病毒斑點抑制之50%有效劑量 43
圖二十.QD58對日本腦炎病毒斑點抑制之50%有效劑量 44
圖二十一. QD52對日本腦炎病毒顆粒活性抑制試驗 45
圖二十二. QD56對日本腦炎病毒顆粒活性抑制試驗 46
圖二十三. QD57對日本腦炎病毒顆粒活性抑制試驗 47
圖二十四. QD58對日本腦炎病毒顆粒活性抑制試驗 48
圖二十五. QD56對日本腦炎病毒貼附抑制試驗 49
圖二十六. QD57對日本腦炎病毒貼附抑制試驗 50
圖二十七. QD58對日本腦炎病毒貼附抑制試驗 51
圖二十八.QD56對IRF-3活化之報導基因試驗 52
圖二十九. QD57對IRF-3活化之報導基因試驗 53
圖三十.QD58對IRF-3活化之報導基因試驗 54
圖三十一.西方墨點法分析QD56、QD58對IRF-3磷酸化之影響 55

 
表目錄
表一. QD52、QD56、QD57以及QD58對BHK-21細胞之50%毒殺濃度(CC50)。 56
表二. QD52、QD56、QD57以及QD58對JEV病毒產率之50%抑制劑量(IC50 for virus yield)。 57
表三.QD52.QD56.QD57.QD58對病毒斑點之50%抑制劑量(IC50)。 58

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