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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:吳瑞鈺
研究生(外文):WU, RUI-YU
論文名稱:香蕉萎縮病病毒之特性及單元抗體
論文名稱(外文):Characterization and monoclonal antibodies of the virus causing banana bunchy-top
指導教授:蘇鴻基蘇鴻基引用關係
指導教授(外文):SU, HONG-JI
學位類別:博士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:植物病蟲害研究所
學門:農業科學學門
學類:植物保護學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1987
畢業學年度:75
語文別:中文
中文關鍵詞:植物病毒香蕉萎縮病單元抗體
外文關鍵詞:PLANTBANANA
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香蕉萎縮病之病毒可經甲改良純化病毒之方法予以純化,其過程包括(1)材料先以
液態氮冷凍,再以乾物粉碎機打碎移入萃取緩衝液中;(2)以氯仿-正丁醇淨化之
後,直接以低高速交換分別離心;(3)沈澱物溶浮後於4℃攪拌二天,並靜置二天
,然後再一次低高速交換離心及以2.5∼30%蔗糖密度梯度(Sucrose density
gradient )離心分層及(4)以分層收集器配合紫外線吸收掃描,而可行到純化病
毒。所得的病蟲收穫量為每100克病植物中平均有20μg左右(6∼64μg)
,且中肋、葉柄之病毒含量比葉片高。若以PEG 沈澱法處理,則所得之純化病毒量較
少;以海砂研磨病組織則使背景雜質增多。以2%Uranyl acetate染色時,病毒大小
為直徑20∼22nm;病毒顆粒之沈澱係數(Sw )約為81S。本病毒之紫外線
吸收光譜為典型之核蛋白吸收曲線,最高吸收值於257∼262nm,最低吸收值於
242∼245nm,且其A/A為1.46。病毒殼蛋白單元之分子量
經測定為21,000;核酸為單股RNA 分子量為2*10。純化病毒雖經各種嘗
試以蕉蚜誘過薄膜飼養或微量注射,但致病力皆極低。長期生長於16℃之病株、蕉
蚜對萎縮病之傳病力降至零,在20℃下者尚有55%傳病力,而27℃時可達10
0%,隨著蕉齡增加,感染率略降低。二個月蕉齡之蕉苗接種病毒後,於30℃溫宜
,發病潛伏期最短(平均26天),而16℃幾乎不顯病微(超過75天);潛伏期
隨蕉齡增右而增長。在40℃/30℃熱處理三週或五週可使病毒量降低,但不能消
滅病毒。在35℃高溫進行組織培養,可使病株長出健康芽由而成無毒化之健株,惟
此健康芽苗經測試不具抗病或耐病性。經RNase 處理的病香蕉處理組織,其切片在電
子顯微鏡下觀察,可於韌皮部薄壁細胞內見到20∼26nm之似病毒顆粒,並且細胞
質及核膜間隙中有含纖維狀物質(Fibrillar material)之泡囊(Vesicle )出現;
亦見核變大扭曲變形,核質累積多量深染物質並有時充滿環狀泡囊。
以純化的莠縮病病毒免疫Balb/C 小白鼠,取其脾臟細胞與骨髓癌細胞(Myeloma ce
ll)進行細胞融合,經過11次的融合試驗後,終經由篩選及單株分離,而得到具特
異性抗體之58個融合瘤細胞株系。其中8個經抗體之亞型測定發現有6個屬IgG2a
系,另2個可能屬IgM 亞型。經測定的9個單元抗體皆不與病毒抗原於瓊脂雙向免疫
擴散反應中生成沈澱帶。單元抗體力價以1B12-Mc3較低,其抗腹水與培養上
澄液之力價分別為10與10;而3D12-Mc2則分別可達10與10
。純化抗體於0.03ppm ∼0.0625ppm 時尚可與抗原產生特異反應。以間接
酵素抗體法則定抗原有效反應稀釋臨界濃度為160ng/ml左右,故需將純化抗原稀
釋至原病材料重量等體積(1/1)之濃度才能被測出,間接ELISA 法測定半純化的
法檢測,病植物汁液中病毒樣品之反應值相當低,而測不出粗汁液中的病毒。若以直
接ELISA 法檢測,病植物汁液中的病毒稀釋至512倍時尚可被測出;而對部份純化
病毒之檢測亦可達原重量200多倍之稀釋度。對純化的病毒,經比較得知直接ELIS
A 法者高出16倍以上,最低可測濃度分別為15ng及260ng。在免疫電子顯微鏡
試驗,單元抗體被覆於銅網膜可以香蕉病組織粗汁液捕捉病毒顆粒。且對病毒顆粒有
修飾(Decoration)反應,但使病毒顆粒腫大或瓦解以間接免疫螢光技術,單元抗體
可與細胞內之病毒反應,而於病組織韌皮部見特異螢光反應。病株中以直接ELISA 法
檢驗發現新葉含病毒量最多;葉片愈老、病毒愈少;葉柄、中肋、假莖的含毒量皆比
葉片多;根中病毒含量甚少;地下莖甚至測不出病毒。吸食病株40小時之帶蕉蚜每
穴(Well)15隻以上的萃取液始能測出病毒反應。除了華蕉之外,呂宋蕉、野生蕉
之萎縮病株皆可直接ELISA 法測出粗汁液中病毒。田間病株附近之似健康蕉株中用直
接ELISA 法可檢驗到帶毒株(7.5%)。
目錄
誌謝
口試合格証明
壹、緒論
貳、前人研究
參、材料與方法
一、香萑萎縮病病毒之萃取與純化
二、香蕉萎縮病病毒形態及特性研究方法
三、香蕉萎縮病傳播生態學試驗方法
四、利用組織培養法嘗試無毒化之試驗方式
五、病態解剖學研究試驗方法
六、單元抗體之製作與純化
七、單元抗體的應用
肆、結果
一、香蕉萎縮病病毒之萃取與純化
二、萎縮病病毒之形態及特性
三、香蕉萎縮病傳播生態學試驗
四、香蕉組織培養法之無毒化試驗
五、香蕉萎縮病之病態解剖學研究
六、單元抗體之製備與應用
伍、討論
陸、中文摘要
柒、英文摘要
捌、參考文獻
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