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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:王湘晴
研究生(外文):HsiangChing Wang
論文名稱:合成與活性評估新型wogonin衍生物作為抗癌藥劑
指導教授:吳進益
學位類別:碩士
校院名稱:國立嘉義大學
系所名稱:生物醫藥科學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2010
畢業學年度:98
語文別:中文
中文關鍵詞:黃芩黃酮類漢黃芩素萜類NWC15抗癌活性
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中藥黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi. 主要具有黃酮類,主要成
分包括 wogonin、baicalin、baicalein 和 oroxylin A。黃酮類具有多種生物及藥理活性,例如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗發炎的特
性。另外,萜類 (Terpenoids) 為天然化合物能增加化合物的脂溶性,
有助於化合物幫助進入細胞內。故本篇研究針對合成 norwogonin
(NW) 在 A 環 C(8) 上的氫氧基位置取代萜類 (isoprenyl、geranyl
及 farnesyl),合成一系列的新型衍生物並且評估其抗癌活性之生物活
性。
分別將 wogonin 及其衍生物 norwogonin (NW) 、NWC5 、
NWC10、NWC15 分別利用人類膀胱癌細胞 (BFTC905)、人類大腸癌
細胞 (SW480)、人類血癌細胞 (HL60)、人類肝癌細胞 (HepG2) 先
進行細胞毒殺試驗 (MTT assay),篩選其最具毒殺能力的衍生物,再
利用流式細胞儀探討細胞週期及 Annexin V-FITC/ PI 雙染觀察細胞
死亡路徑,進而利用西方墨點法觀察蛋白質表現量。
在 MTT 試驗結果發現 NWC15 在 BFTC905 細胞株中最具毒
殺作用 (IC50 = 5.6 ± 0.78 μM),且毒殺效果較 wogonin (IC50 = 16.8 ± 1.10 μM)佳。故本篇研究以 BFTC905 作為評估新型衍生物的生物活性。我們利用流式細胞儀進行細胞週期的分析,分別在24、48小時加
藥培養後,發現細胞 G1 略為增加,另外48小時,40 μM 的 wogonin
及 NWC15 的 SubG1 都有明顯增加。進而透過 Annexin V-FITC/PI
雙染結果觀察到20、40 μM 的 wogonin 及 NWC15 在 BFTC905 可
造成細胞壞死 (necrosis)。細胞壞死會促使細胞膜破裂,使細胞內的
lactate dehydrogenase (LDH) 大量釋出,此結果發現在48小時,其
20、40 μM 的 wogonin 及 NWC15 在 BFTC905 中均會造成 LDH
釋出。另外,傳統抗癌藥物經由細胞凋亡路徑,都會導致 Poly ADP
ribose polymerase (PARP) 斷裂位置由113 KDa 斷裂至89 KDa,但由
西方墨點法中 wogonin 及 NWC15 無法觀察到 PARP 在89 KDa 斷
裂的表現,表示 wogonin及 NWC15在 BFTC905 細胞中無並非走傳
統細胞凋亡路徑。細胞壞死大多會引發細胞發炎,故利用西方墨點法
觀察 COX-2 表現量,結果發現 wogonin 及 NWC15 皆有造成
COX-2 表現量增加,其中以 NWC15 表現 COX-2 量最多。綜合以
上結果, NWC15 造成人類膀胱癌細胞株 (BFTC905) 死亡路徑可能
是經由細胞壞死導致細胞死亡,顯示 NWC15 可能具有潛力發展成新
型抑制膀胱癌藥劑。
目錄………………………………………………..……………………...I
表目錄…………………...…………………………..………………….IV
圖目錄……………………………………………………….…………..V
中文摘要……………………………………………….………..……VIII
英文摘要………………………………………………………………...X
第一章 緒論………………...………………………………………1
第一節、中藥黃芩之簡介…………………………………………...2
第二節、萜類之簡介………………………………………………...7
第三節、惡性腫瘤…………………………………………………...9
一、 膀胱癌……………………………………………………9
二、 大腸癌…………………………………………….…….10
三、 白血病…………………………………………………..11
四、 肝癌………………………………………………..……12
第四節、細胞週期………………………………………………….14
第五節、細胞凋亡或壞死………………………………………….16
第二章 研究動機及目的…………………………………………..18
第三章 材料與方法…………………………………...…………...19
第一節、實驗試劑與試藥………………………………………….19
第二節、實驗儀器………………………………………………….23
第三節、黃芩成分萃取方法……………………………………….25
第四節、黃酮類衍生物之合成…………………………………….26
第五節、生物活性試驗…………………………………………….35
一、細胞株………………………..……………………………35
二、繼代培養…………………………………………..………35
三、冷凍細胞……………………………………………….….36
四、解凍細胞……………………………………………..……36
五、計數細胞……………………………………………..……37
六、細胞培養試劑之配法……………………………………..37
七、細胞存活率…………………………………………….….38
八、細胞週期分析…………………………………….……….39
九、細胞死亡路徑測定…………………………………….….41
十、乳酸脫氫酶釋放………………………………………..…42
十一、西方墨點法………………………………………..……43
第六節、統計分析………………………………………………….50
第四章 結果與討論……………………………………...………...51
第一節、Norwogonin 衍生物之合成……………………………51
第二節、探討 wogonin 及其衍生物在不同癌細胞的細胞存活試
驗………………………………………………………...51
第三節、萜類 (isoprenol、geranol 及farnesol) 在BFTC905 細胞
中的細胞存活試驗……………………………………...52
第四節、比較wogonin、farnesol 及 NWC15 對 BFTC905 細胞毒
性之差異性……………………………………………...53
第五節、探討 wogonin 及其衍生物在 BFTC905 細胞內外之含
量…………………...……………………………………54
第六節、探討 wogonin 及其衍生物在 BFTC905 細胞中不同時
間的細胞毒性之評估…………………………………...55
第七節、探討 wogonin 及其衍生物藥物處理後觀察 BFTC905
細胞之細胞型態………………………………………...55
第八節、探討 wogonin 及其衍生物在 BFTC905 細胞之細胞週
期影響…………………………………………………...56
第九節、探討 wogonin 及NWC15 在 BFTC905 細胞之死亡路
徑………………………………………………………...57
第十節、探討 wogonin 及NWC15 在 BFTC905 細胞之 LDH 釋
放能力…………………………………………………...57
第十一節、探討 wogonin 及NWC15 在 BFTC905 細胞壞死之機
制………………………………………………………58
第十二節、比較 wogonin 及 NWC15 在 SW480 及 HL60 細胞
株細胞死亡路徑………………………………………60
第五章 結論……………………………...…………………………….93
第六章 參考文獻………………………………………………………96
附錄……………………………………………………….………...…107
行政院衛生署統計資料網公告.
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