臺灣博碩士論文加值系統

本實驗之目的是藉著轉移來自不同品種鴨的始基生殖細胞，以生產嵌合鴨。將預先孵化的番鴨（Muscovy duck；Mus. or M）胚，取其性腺中的始基生殖細胞，約 200 個，作為供應細胞，利用顯微注射的技術，移植到事先孵化的接受注射對象之褐色菜鴨（Brown Tsiya ducks；BT）胚的血液循環中，使來自供應胚的始基生殖細胞，可繼續在接受胚的血管中，回復進行自然狀態下的遷移運動。以番鴨胚（M）的始基生殖細胞，注射入褐色菜鴨胚（BT）中，所產製的嵌合鴨，以BT(M)表示。
對照雞胚發育階段的文獻資料，確定欲取鴨胚的所需發育天數。目前初步依照比對雞胚與鴨胚的胚胎大小的結果，以及雞胚發育分期所依據的特徵描述，認為以 7 ~ 9天的番鴨胚（雞胚為stage 27；5天），取其原始性腺中的始基生殖細胞 ，注射入 3 ~ 4 天的褐色菜鴨胚（雞胚約為stage 14 ~ 17； 50 ~ 53 hours ~ 52 ~ 64 hours；2.5天）血液循環血管中，來產製嵌合鴨最適當。由供應者的番鴨胚性腺中所分離的始基生殖細胞，在注射之前的平均存活率為75.2％。
本試驗採用RAPD PCR方法之目的，在檢測萃取自接受注射的褐色菜鴨胚性腺中之DNA，是否含有由當作供應者的番鴨胚性腺中所分離，而再經顯微注射技術轉移至接受注射的褐色菜鴨胚血管中的始基生殖細胞，再由其中萃取得到的外源性DNA。因此必須由許多測試的引子中，藉著使用某一個引子，尋找能呈現外源性DNA的多型性，進而可用來區別供應鴨胚與接受鴨胚之間的差異，而可供利用之遺傳標記。然後，應用此一個引子，檢測是否接受注射胚含有能產生專一的外源DNA多型性的遺傳標記。因此根據推測，確定存活的接受注射胚將發育成為生殖系嵌合鴨（germline chimeric duck）。結果顯示在實驗的73隻死亡的接受注射胚BT(M)之DNA樣本中，有13隻，在約410kb處，呈現番鴨胚所具有的專一性電泳帶，而褐色菜鴨胚並沒有此一電泳帶，故以此確定含有來自於供應鴨胚的外源DNA。
經過注射處理後，順利孵出8隻，其中三隻分別又於1或2日內死亡，故僅獲得5隻，其中3隻為BT（M），前2隻為雌性，第3隻為雄性，其餘另外的2隻為M（BT），第1隻為雌性，第2隻為雄性。將這5隻飼養至性成熟且均具有正常的生殖能力，故開始以人工授精的方式，分別與相反性別的純種番鴨或褐色菜鴨作配種試驗，而將可由後代的毛色或形態來鑑定其是否為嵌合鴨，惟本項工作尚待進一步的測試確定。

The purpose of this experiment was to produce germline chimeric ducks by transferring the primordial germ cells（PGCs）from the different duck species.PGCs about 200 as the donor cells from the gonads of the advance incubated donor Muscovy duck embryos was transplanted into the blood circulation of the advance incubated embryos of the Brown Tsiya ducks as the injected recipient target by the microinjection technology, and was recovered to perform the migration movement continuously by nature in the blood vessels of these recipient embryos. The Brown Tsiya ducks（BT） injected with the PGCs of the Muscovy duck（M）to produce germline chimeric ducks are referred to as BT（M）.
According to the reference of the development stages of the chicken embryos, the desired development stage of the duck embryos were confirmed. On the basis of comparing the embryo size of the chicken and the duck, and descripting characteristics which was used for dividing each development stage of the chicken embryo, it is most proper to produce germline chimeric ducks by transferring the microinjected PGCs which were isolated from the gonads of the 7 to 9-day-old incubated Muscovy ducks embryo whose development stage was equal to the 5-day-old （stage 27）chicken embryo into the blood circulating vessels of the 3 to 4-day-old Brown Tsiya duck embryo whose development stage was equal to the approximately 2.5-day-old （stage 14~17； 50~53 hours ~ 52~64 hours）chicken embryo. Just before performing microinjection, the average survival rate of PGCs was 75.2%.
Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction（RAPD PCR）used in this experiment was to detect that if the DNA which was extracted from the ganads of the injected recipient Brown Tsiya duck embryos contained the foreign DNA which was extracted from the PGCs which were isolated from the donor Muscovy duck embryonic gonads , and then was transferred into the injected recipient Brown Tsiya duck embryonic blood vessels by the microinjection technology. Therefore, the available genetic markers presenting the foreign DNA polymorphism which could be used to distinguish the differences between the donor duck embryos and the recipient ones should be found by using a certain primer from many tested ones. Then this primer would be applied to detect if the injected embryos contained the foreign DNA which would result in the specific foreign DNA polymorphic genetic markers, and thus to identify that the survival injected embryos would develop to be the germline chimeric ducks supposedly.The results showed that there were 13 of the 73 dead embryonic DNA samples presenting the specific electrophoretic band which Muscovy duck possessed, but Brown Tsiya duck did not have at approximately 410 kb, so containing the foreign DNA from the donor duck embryos to be confirmed by this method.
Finally, there were 8 injected embryos which were hatched, but 3 of those died within 1 or 2 days separately, thus only 5 survival ducks. In the 5 ducks, the 3 ones were BT（M）in which the first two were female, and the third one was male, and the 2 others were M（BT）in which the first one was female and the second one was male. The total 5 hatched recipient ducks were brought up to sexual maturity. All of them were fertile, so they were mating with the oppositely sexual and pure M or BT duck species, and will be identified whether they are the germline chimeric ducks or not by the feather colour or the figure of their progenies further.

目錄
中文摘要……………………………………………………………………Ⅰ
英文摘要……………………………………………………………………Ⅲ
誌謝…………………………………………………………………………Ⅵ
目錄…………………………………………………………………………Ⅶ
圖表目錄……………………………………………………………………Ⅶ
壹、前言……………………………………………………………………1
貳、文獻檢討………………………………………………………………3
一、始基生殖細胞的優勢………………………………………………3
二、始基生殖細胞的來龍去脈…………………………………………3
三、始基生殖細胞的檢測………………………………………………14
四、始基生殖細胞的應用………………………………………………15
五、始基生殖細胞的分離純化…………………………………………16
六、始基生殖細胞的體外培養…………………………………………17
七、始基生殖細胞的取得來源與嵌合體家禽的生產…………………17
八、逢機增製多型性DNA片段（random amplified polymorphic
DNA, RAPD ）之聚合連鎖反應 （ polymerase chian
reaction, PCR）方法之探討………………………………………19
（一）RAPD PCR基本原理、特性之探討………………………………19
Ⅰ.基本原理………………………………………………………19
Ⅱ.產生RAPD PCR多型性的因素…………………………………20
（二）RAPD PCR的優點…………………………………………………21
（三）RAPD PCR的應用…………………………………………………22
（四）RAPD PCR的延伸…………………………………………………23
（五）使用RAPD PCR的限制與潛在問題………………………………25
（六）本試驗採用RAPD PCR方法之目的………………………………25
參、材料與方法……………………………………………………………26
一、實驗設計……………………………………………………………26
二、材料…………………………………………………………………26
三、方法…………………………………………………………………26
（一）生產嵌合鴨的方法………………………………………………26
Ⅰ.先前準備事項…………………………………………………26
1.製顯微針……………………………………………………26
2.滅菌…………………………………………………………31
3.事先準備好供試動物與純種受精蛋………………………31
4.預先製備溶液………………………………………………31
Ⅱ.操作步驟………………………………………………………32
1.無菌操作、取胚、取早期性腺、取始基生殖細胞………32
2.離心…………………………………………………………32
3.製備細胞濃縮小滴…………………………………………32
4.鋸蛋…………………………………………………………33
5.顯微注射操作………………………………………………33
6.染色…………………………………………………………41
7.封蛋…………………………………………………………41
8.孵化…………………………………………………………43
9.死胚的處置…………………………………………………43
（二） 鑑定注射之外來DNA，是否存在於預定的胚胎性腺內………44
Ⅰ. 萃取中途死亡胚胎性腺內的DNA……………………………44
1.先前準備事項………………………………………………44
2.操作步驟……………………………………………………44
Ⅱ. RAPD PCR 之利用……………………………………………46
1.RAPD PCR反應………………………………………………46
2.RAPD PCR反應溶液之成分…………………………………46
3.RAPD PCR反應之條件………………………………………47
4.RAPD PCR產物之電泳分析…………………………………47
Ⅲ. RAPD PCR 指印分析…………………………………………47
Ⅳ.人工授精配種試驗，後代毛色鑑定…………………………48
肆、結果與討論……………………………………………………………51
一、確定胚胎中，germinal ridge的所在位置………………………51
二、確定實驗所需鴨胚最適當的發育天數……………………………54
三、獲得始基生殖細胞，並計算細胞數目……………………………56
四、以trypan blue 染色法計算始基生殖細胞的平均存活率………58
五、以PAS（periodic acid-schiff）染色法，確定所取細胞為
始基生殖細胞………………………………………………………64
六、確立注射胚胎血管的技術及最佳注射部位為背動脈……………66
七、封蛋技術的建立……………………………………………………69
八、確立整個產製嵌合鴨的流程及相關技術…………………………71
九、受注射胚孵化且具有正常的生殖能力……………………………72
十、以RAPD PCR的方法加以鑑定………………………………………78
十一、人工授精，後代毛色鑑定………………………………………85
十二、胎死蛋中可能的原因……………………………………………86
（一）胚胎暴露於空氣中時間過久……………………………………86
（二）溫度不適當………………………………………………………86
（三）濕度不適當………………………………………………………88
（四）卵黃膜於注射時有受損或黏著…………………………………89
（五）注入物不適當、注射傷害………………………………………90
（六）病菌污染…………………………………………………………90
（七）其他原因…………………………………………………………91
十三、以RAPD PCR的方法鑑定未果的可能原因………………………92
（一）鑑定對象並非嵌合鴨……………………………………………92
（二）注入的外源性DNA不夠多， 未能鑑定出來……………………92
（三）引子（primer）不正確，結合專一性不夠好…………………92
（四）其他原因…………………………………………………………93
十四、其他有潛力達成高嵌合率的方法………………………………93
伍、結論……………………………………………………………………94
陸、參考文獻………………………………………………………………95
圖表目錄
圖1、胚盤區結構示意圖 …………………………………………………4
圖2、胚盤的發育 …………………………………………………………5
圖3、細胞在胚葉中遷移 …………………………………………………6
圖4、始基生殖細胞遷移至生殖新月區 …………………………………7
圖5、始基生殖細胞的遷移 ………………………………………………8
圖6、始基生殖細胞遷移至生殖而發展成早期性腺 …………………9
圖7、始基生殖細胞遷移至生殖而發展成早期性腺 …………………10
圖8、早期性腺分化發展 …………………………………………………11
圖9、製備顯微針（micropipette）示意圖 ……………………………27
圖10、垂直式拉針…………………………………………………………28
圖11、磨針器………………………………………………………………29
圖12、切針、銳針、彎針之多功能製針器………………………………30
圖13、Ficoll離心後，吸取位於界面的細胞……………………………34
圖14、照蛋器………………………………………………………………35
圖15、鋸蛋器………………………………………………………………36
圖16、接受注射的胚胎開窗蛋……………………………………………37
圖17、以顯微針吸取始基生殖細胞………………………………………38
圖18、在顯微鏡視野中確定以顯微針吸取一定數量的始基生殖細胞…39
圖19、顯微注射操作………………………………………………………40
圖20、以3M Tegaderm 膠膜封蛋…………………………………………42
圖21、採精…………………………………………………………………49
圖22、採精器………………………………………………………………50
圖23、供應胚與取出的中腎………………………………………………52
圖24、中腎，及內側原始性腺的形狀與尺寸（mm）……………………53
圖25、供應胚的外觀與尺寸………………………………………………55
圖26、血球計數板上的始基生殖細胞……………………………………57
圖27、以trypan blue 染色法，確定始基生殖細胞已死亡……………62
圖28、以trypan blue 染色法，比較始基生殖細胞的死活……………63
圖29、以PAS（periodic acid-schiff）染色法確定始基生殖細胞 …65
圖30、接受注射始基生殖細胞的胚胎，血管分佈狀態…………………67
圖31、接受注射始基生殖細胞的胚胎，及背動脈注射部位……………68
圖32、單獨或合併使用paraffin film及蛋殼膜來封蛋 ………………70
圖33、產製嵌合鴨的整個實驗流程圖……………………………………71
圖34、試驗初期、中期，胚胎存活天數紀錄……………………………73
圖35、試驗後期，胚胎存活天數紀錄……………………………………74
圖36、接受注射始基生殖細胞的胚胎BT（M）出雛 ……………………75
圖37、接受注射始基生殖細胞的胚胎BT（M）出雛 ……………………76
圖38、接受注射始基生殖細胞的胚胎BT（M）成鴨 ……………………77
圖39、RAPD PCR的電泳鑑定結果…………………………………………80
圖40、RAPD PCR的電泳鑑定結果…………………………………………81
圖41、RAPD PCR的電泳鑑定結果…………………………………………82
圖42、RAPD PCR的電泳鑑定結果…………………………………………83
圖43、RAPD PCR的電泳鑑定結果…………………………………………84
表1、取自胚胎性腺的PGC平均存活率……………………………………59
表2、RAPD PCR鑑定結果 …………………………………………………78

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