臺灣博碩士論文加值系統

聚合酶連鎖反應（PCR）是可以複製特定的DNA片段的技術，然而此技術需使用一台體積龐大的熱循環儀才可進行，因此為了改善這個問題，本文研製了一個連續流體方式PCR晶片。首先以商用模擬軟體CFD-ACE+TM模擬本文所配置的三個溫度區域對於晶片之影響，確認溫度分布後，便可加入微流道進行模擬，探討裝置的可行性與相關參數。實驗方面，首先以微機電製程技術與聚二甲基矽氧烷(PDMS)翻模技術，製作出具有微流道之晶片，而溫度的部分是在晶片下方兩側，配置兩個不同溫度的加熱模組，而中間設置冷卻區域，將熱能傳導至散熱區，使得晶片中央溫度下降，而溫度控制是使用8051單晶片與測溫元件所組成，透過上述之條件，實際檢測晶片之溫度發現到晶片內與外具有7~8K的溫度差，因此運用此結果搭配紅外線熱像儀，便可達成三個穩定溫區，成功建立出PCR所需之環境後，接著對於晶片的微流道表面進行優化，本文採用三種表面鈍化試劑進行比較，吐溫 20（Tween 20）濃度為20%時，能明顯減少PDMS表面的甲基（CH3）光譜，而表面的平均粗糙度約61nm，明顯優於其他兩種，接著運用試劑均可溶於水的特性，以去離子水進行觀察，發現Tween 20可使PDMS改變為親水性，因此可了解到Tween 20鈍化效果最為良好。接著實際運用於生物實驗，結果顯示本文裝置成功複製了DNA片段，擴增時間為50min，並且透過鈍化處理能有效的幫助DNA複製，接著對於裝置進行探討，發現流量在1μl/min與樣品量在10μl以上時，雖然無法媲美市售PCR熱循環儀，但是無論實驗時間或實驗結果，均能達成一個最佳之平衡點。
關鍵詞：連續流體式PCR、微流體晶片、聚合酶鏈鎖反應、鈍化反應、聚二甲基矽氧烷。

The polymerase chain reaction (PCR) is a technique that can duplicate specific DNA fragments, however, conducting the technique requires the use of a very large-scale thermal cycler. In order to accommodate for this problem, this study has developed a continuous flow PCR chip. Initially, CFD-ACE+TM commercial simulation software is used to simulate the impact that the three temperature zones configured in this paper have on the chip. After confirming the temperature distribution, microfuidic channels can be added to the simulations in order to investigate the feasibility and related parameters of the apparatus. In the experimentation, initially, a microelectromechanical processing technique and polydimethylsiloxane (PDMS) formwork technique were used to create a chip with microfuidic channels. For the temperature, on the two sides of the bottom of the chip, two heating modules were configured with different temperatures and a cooling zone was set up in the center to allow the thermal energy to transfer to the heat dissipation zone and allow the temperature of the chip’s center to decrease. The temperature control was composed of an 8051 single chip and temperature measurement device, which, the actual detection of wafer temperature was found to have the chip temperature difference between the inside and outside within 7-8K, Thus the use of this result with infrared thermal imager, by using the abovementioned conditions, could create three stable temperature zones.
After successfully establishing the environment necessary for the PCR, optimization was conducted on the surface of the chip’s microfluidic channels. This paper used three types of surface passivation reagents to conduct comparisons and discovered that when the polysorbate 20 (Tween 20) has a concentration of 20%, it can significantly reduce the methyl (CH3) spectroscopy on the PDMS surface, resulting in an average surface roughness which is approximately 61nm. This outcome was significantly more favorable than the other two types. Also, as all the reagents used are water soluble, deionized water was used to conduct observations, and it was discovered that the Tween 20 can cause the PDMS to become hydrophilic; thus it can be seen that the Tween 20 has the optimal passivation effect. Furthermore, when applied to actual biological experiments, the results indicated that the apparatus successfully duplicated the DNA fragments and that use of passivation treatment can effectively help the response of the DNA copies. The experimental time was 50 min.Then for the device to explore, discover traffic 1μl/min and the sample volume at the time of 10μl or more, although not comparable to commercially available PCR thermal cycler, but no matter the time or the experimental results, the best able to reach a balance.
Keywords：Continuous fluid PCR、Microfluidic chip、Polymerase chain reaction、Passivation、PDMS

摘　　要 I
Abstract III
謝　　誌 V
目　　錄 VI
表　　目　　錄 IX
圖　　目　　錄 X
第一章 緒論 1
1.1研究背景 1
1.2 研究動機 3
第二章 文獻探討 4
2.1微型PCR熱循環儀 4
2.1.1腔體式PCR裝置 5
2.1.2連續流動式PCR裝置 7
2.2表面處理 10
2.3溫控模組 14
第三章 理論分析與數值模擬 18
3.1熱傳導原理 18
3.1.1整體裝置 18
3.1.2微流道管道 19
3.2數值模擬 21
第四章 實驗設備與實驗方法 23
4.1實驗架構 23
4.2微流體晶片 24
4.2.1微流道設計 25
4.2.2微流道公模研製 26
4.2.3公模檢測 28
4.2.4 PDMS翻模與晶片接合 30
4.2.5 PDMS母模檢測 32
4.3溫控模組與夾具製作 33
4.3.1自製溫控系統 34
4.3.2加熱模組與冷卻模組 35
4.3.3夾具製作 36
4.4樣品驅動 37
4.5溫度量測 38
4.6表面鈍化 39
4.6.1試劑 40
4.6.2表面檢測 41
5.1模擬參數 44
5.2裝置模擬與分析 45
5.3微流道模擬與分析 47
5.4溫度量測 57
5.4.1加熱裝置 57
5.4.2晶片量測 58
5.5表面處理比較 61
5.5.1表面結構之比較 62
5.5.2表面粗糙度比較 67
5.5.3親疏水性比較 71
5.6實際應用於PCR 74
5.6.1PCR實驗操作 75
5.6.2表面處理對PCR擴增的影響 76
第六章 結論與建議 82
6.1結論 82
6.2建議 83
參考文獻 84
作者簡介 87


表　　目　　錄
表4-1、前處理流程 26
表4-2、微流道公模製作流程 28
表4-3、微流道晶片製作流程 32
表5-1、晶片材質之設定參數 44
表5-2、模擬液體之設定參數 47
表5-3、微流道流量、流速與雷諾數對照表 48
表5-4、拓寬流道的樣品停留時間 56
表5-5、表面鈍化試劑濃度 62
表5-6、PDMS光譜對照表 63
表5-7、不同表處試劑的薄膜平均粗糙度 73
表5-8、執行PCR樣品濃度調配 76


圖　　目　　錄
圖1-1、PCR循環示意圖 2
圖1-2、PCR循環儀的演變過程 3
圖2-1、現今PCR熱循環儀研究方向 4
圖2-2、2007年，Ke等人[1] 6
圖2-3、2008年，Christensen等人[2] 6
圖2-4、2010年， Trung等人[3] 6
圖2-5、2010年， Yotoriyama等人[4] 7
圖2-6、2012年， Kim等人[5] 7
圖2-7、2003年，Curcio等人[6] 9
圖2-8、2006年，Li等人[7] 9
圖2-9、2008年，Joung等人[8] 9
圖2-10、2009年，Wang等人[9] 9
圖2-11、2012年，Peham等人[10] 9
圖2-12、2012年，Chen等人[11] 10
圖2-13、2000年，Lee等人[12] 12
圖2-14、2001年，Schneegaß等人[13] 12
圖2-15、2002年，Felbel等人[14] 12
圖2-16、2006年，Zhang等人[15] 12
圖2-17、2006年，Kim等人[16] 13
圖2-18、2007年，Xia等人[17] 13
圖2-19、2008年，Kuan等人[18] 13
圖2-20、1998年，Kopp等人 [19] 15
圖2-21、2000年，Lao等人[20] 15
圖2-22、2001年，Zhang等人[21] 15
圖2-23、2007年，Tsai 等人[22] 16
圖2-24、2010年，Zhang等人[23] 16
圖2-25、2014年，Chung等人[24] 16
圖3-1、物理模型圖 18
圖3-2、微流道物理模型圖 20
圖3-3、模擬設計架構圖 22
圖4-1、實驗架構圖圖 23
圖4-2、裝置展開示圖 24
圖4-3、晶片製作流程圖 25
圖4-4、微流道設計圖與菱型流道圖 26
圖4-5、微流道公模 27
圖4-6、表面輪廓量測儀與探針 29
圖4-7、公模檢測圖（a）第8個熱循環（b）第22個熱循環 29
圖4-8、PDMS分子結構與聚合反應 30
圖4-9、氧電漿清洗機與電漿過程圖 31
圖4-10、晶片完成圖 31
圖4-11、金相顯微鏡 32
圖4-12、PDMS脫模圖 32
圖4-13、金相顯微鏡檢測圖 33
圖4-14、自製溫控模組 33
圖4-15、溫控模組流程圖 34
圖4-16、8051單晶片與測溫元件 34
圖4-17、加熱棒與加熱鋁塊 35
圖4-18、冷卻模組實體圖 35
圖4-19、桌上型三軸高速薄板雕刻機 36
圖4-20、絕熱載具 37
圖4-21、裝置實體圖 37
圖4-22、注射幫浦與針具 38
圖4-23、紅外線熱像儀 38
圖4-24、測溫晶片與熱電偶溫度計 39
圖4-25、感溫變色染劑 39
圖4-26、BSA表面處理試劑 40
圖4-27、PVP與Tween 20 41
圖4-28、表面處理分析圖 41
圖4-29、傅立葉轉換紅外光譜儀與固態量測模組 42
圖4-30、原子力顯微鏡與量測示意圖 43
圖4-31、接觸角量測儀與量測示意圖 43
圖5-1、晶片模擬圖 44
圖5-2、晶片剖面溫度（每條曲線代表差1K），由（a）到（d）的低溫區溫度分別為323、328、333、338K。 45
圖5-3、晶片和接合面溫度 46
圖5-4、PDMS厚度與內外部溫度關係圖 46
圖5-5、微流道模擬圖與微流道 48
圖5-6、傳統型微流道溫度曲線圖 49
圖5-7、微流道溫度分布，由（a）到（e）的流量分別是5、7、10、15、20μl/min 50
圖5-8、拓寬流道溫度曲線圖 51
圖5-9、拓寬流道之溫度變化圖，（每條曲線代表差0.1度） 52
圖5-10、拓寬流道的流場圖，由（a）到（f）的流量分別為0.1、1、5、7、10和15μl/min 53
圖5-11、拓寬流道的溫度等高圖，由（a）到（f）的流量分別為0.1、1、5、7、10和15μl/min 54
圖5-12、150與650μm的流速剖面圖 55
圖5-13、650μm流道剖面溫度（每條曲線代表差0.1度），由（a）到（f）的流量分別為0.1、1、 5、 7、 10、 15μl/min 55
圖5-14、拓寬流道的平均流速圖 56
圖5-15、DS1821溫度擷取圖 57
圖5-16、紅外線熱影像擷取溫度示意圖 58
圖5-17、溫度量測點的分布圖 59
圖5-18、表面與內部溫度曲線圖 59
圖5-19、傳統型流道溫度染劑圖 60
圖5-20、拓寬流道溫度染劑圖 60
圖5-21、胺基酸縮合反應 61
圖5-22、PDMS分子結構圖 62
圖5-23、PDMS吸收光譜 63
圖5-24、BSA修飾後PDMS的吸收光譜 64
圖5-25、BSA修飾後甲基光譜比較 64
圖5-26、PVP修飾後PDMS的吸收光譜 65
圖5-27、PVP修飾後甲基光譜比較 65
圖5-28、Tween 20修飾後PDMS的吸收光譜 66
圖5-29、Tween 20修飾後甲基光譜比較 67
圖5-30、PDMS表面2D與3D影像 68
圖5-31、Tween 20濃度10%之表面2D與3D影像圖 69
圖5-32、Tween 20濃度20%之表面2D與3D影像圖 69
圖5-33、BSA濃度1mg/ml之表面2D與3D影像圖 69
圖5-34、BSA濃度2mg/ml之表面2D與3D影像圖 69
圖5-35、PVP濃度1mg/ml之表面2D與3D影像圖 70
圖5-36、PVP濃度2mg/ml之表面2D與3D影像圖 70
圖5-37、AFM量測數據圖，PDMS為未處理，T為Tween 20，B為BSA， P為PVP 71
圖5-38、PDMS接觸角量測圖 72
圖5-39、BSA親疏水性比較圖 73
圖5-40、PVP親疏水性比較圖 73
圖5-41、Tween 20親疏水性比較圖 74
圖5-42、PCR操作流程圖 76
圖5-43、有無表面處理凝膠電泳圖與量化圖 77
圖5-44、不同表處試劑對於PCR之影響，T：Tween 20、B：BSA、P：PVP 78
圖5-45、PCR重複性之測試圖，T為Tween 20，B為BSA， P為PVP 79
圖5-46、PCR流量之測試，流量分別為0.5、0.7、1、1.5、2μl/min，其反應時間分別約為86min、90min、70min、50min、30min、20min 81
圖5-47、不同樣品量之比較，其劑量分別為5、10、20、40μl，其反應時間分別約為86min、30min、50min、75min、100min 82

[1] Ke, C., Kelleher, A. M., Berney, H., Sheehan, M., &; Mathewson, A. (2007). Single step cell lysis/PCR detection of Escherichia coli in an independently controllable silicon microreactor. Sensors and Actuators B: Chemical, 120(2), 538-544.
[2] Christensen, T. B., Bang, D. D., &; Wolff, A. (2008). Multiplex polymerase chain reaction (PCR) on a SU-8 chip. Microelectronic Engineering, 85(5), 1278-1281.
[3] Trung, N. B., Saito, M., Takabayashi, H., Viet, P. H., Tamiya, E., &; Takamura, Y. (2010). Multi-chamber PCR chip with simple liquid introduction utilizing the gas permeability of polydimethylsiloxane. Sensors and Actuators B: Chemical, 149(1), 284-290.
[4] Yotoriyama, T., Watanabe, K., Anaguchi, T., Miyachi, M., Abe, T., Watanabe, H., Ichimura, I., Segawa, Y., Shimizu, N., &; Yasuda, A. (2010). Miniaturized PCR device for rapid detection of infectious agents, In 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, pp. 142-144, Groningen, The Netherlands.
[5] Kim, J. D., Park, C. Y., Gwak, O. D., Kim, S. Y., Lee, D. J., Kim, Y. S., &; Song, H. J. (2012). Chamber temperature measurement of micro PCR chip using thermocouple. International Journal of Multimedia and Ubiquitous Engineering, 7(2), 395-402.
[6] Curcio, M., &; Roeraade, J. (2003). Continuous segmented-flow polymerase chain reaction for high-throughput miniaturized DNA amplification. Analytical Chemistry, 75(1), 1-7.
[7] Li, S., Fozdar, D. Y., Ali, M. F., Li, H., Shao, D., Vykoukal, D. M., Vykoukal, J., Floriano, P. N., Olsen. M., McDevitt, J. T., Gascoyne, P. R. C., &; Chen, S. (2006). A continuous-flow polymerase chain reaction microchip with regional velocity control. Journal of Microelectromechanical Systems, 15(1), 223-236.
[8] Joung, S. R., Kang, C. J., &; Kim, Y. S. (2008). Series DNA amplification using the continuous-flow polymerase chain reaction chip. Japanese Journal of Applied Physics, 47(2), 1342-1345.
[9] Wang, J. H., Chien, L. J., Hsieh, T. M., Luo, C. H., Chou, W. P., Chen, P. H.,Chen, P. J., Lee, D. S., &; Lee, G. B. (2009). A miniaturized quantitative polymerase chain reaction system for DNA amplification and detection. Sensors and Actuators B: Chemical, 141(1), 329-337.
[10] Peham, J. R., Recnik, L. M., Grienauer, W., Vellekoop, M. J., N#westeur055#hammer, C., &; Wiesinger-Mayr, H. (2012). Disposable microfluidic chip for rapid pathogen identification with DNA microarrays. Microsystem Technologies, 18(3), 311-318.
[11] Chen, P. C., Fan, W., Hoo, T. K., Chan, L. C. Z., &; Wang, Z. (2012). Simulation guided-design of a microfluidic thermal reactor for polymerase chain reaction. Chemical Engineering Research and Design, 90(5), 591-599.
[12] Lee, T. M., Hsing, I. M., Lao, A. I., &; Carles, M. C. (2000). A miniaturized DNA amplifier: its application in traditional Chinese medicine. Analytical Chemistry, 72(17), 4242-4247.
[13] Schneega#westeur032#, I., Br#westeur037#utigam, R., &; K#westeur055#hler, J. M. (2001). Miniaturized flow-through PCR with different template types in a silicon chip thermocycler. Lab on a Chip, 1(1), 42-49.
[14] Felbel, J., Bieber, I., &; Koehler, J. M. (2002). Chemical surface management for micro PCR in silicon chip thermocyclers. Biomedical Applications of Micro- and Nanoengineering, 4937, 34-40.
[15] Chunsun, Z., Jinliang, X., Jianqin, W., &; Hanping, W. (2006). Continuous-flow polymerase chain reaction microfluidics based on polytetrafluoethylene capillary. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 34(8), 1197-1203.
[16] Kim, J. A., Lee, J. Y., Seong, S., Cha, S. H., Lee, S. H., Kim, J. J., &; Park, T. H. (2006). Fabrication and characterization of a PDMS–glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal, 29(1), 91-97.
[17] Xia, Y. M., Hua, Z. S., Srivannavit, O., Ozel, A. B., &; Gulari, E. (2007). Minimizing the surface effect of PDMS–glass microchip on polymerase chain reaction by dynamic polymer passivation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 82(1), 33-38.
[18] Kuan, I., Gu, W., Wu, J., Wei, C., Chen, K., &; Yu, C. (2008). Effects of grafting poly (ethylene oxide) on the amplification efficiency of a poly (dimethylsiloxane)-based flow-through PCR device. Chemical Engineering Journal, 143(1), 326-330.
[19] Kopp, M. U., De Mello, A. J., &; Manz, A. (1998). Chemical amplification: continuous-flow PCR on a chip. Science, 280(5366), 1046-1048.
[20] Lao, A. I., Lee, T. M., Hsing, I., &; Ip, N. Y. (2000). Precise temperature control of microfluidic chamber for gas and liquid phase reactions. Sensors and Actuators A: Physical, 84(1), 11-17.
[21] Zheng, W., &; Chen, S. (2001). Continuous-flow submicroliter-scale PCR chip for DNA amplification. In: Micromachining and Microfabrication, Proceedings of SPIE, Vol. 4560, p. 256-262.
[22] Tsai, N. C., &; Sue, C. Y. (2007). Thermal control of micro reverse transcription-polymerase chain reaction systems. Sensors and Actuators A: Physical, 136(1), 178-183.
[23] Zhang, C., &; Xing, D. (2010). Microfluidic gradient PCR (MG-PCR): a new method for microfluidic DNA amplification. Biomedical Microdevices, 12(1), 1-12.
[24] Chung, K. H., Choi, Y. H., &; Park, S. (2014). Development of a continuous-flow polymerase chain reaction device utilizing a polymer disk with a spiral microchannel of gradually varying width. Sensors and Actuators B: Chemical, 191, 75-85.
[25] 榮國斌，2006，大學有機化學基礎，華東理工大學出版社，上海，第165頁。
[26] 翁詩甫，2005，傅里葉變換紅外光譜儀，化學工業處版社，北京，第239頁。
[27] 謝雅玉，2005，用於微晶片之聚雙甲基矽氧烷基材表面穩定化學修飾，國立成功大學化學系碩士論文，臺南。
[28] 梁文憲，2006，兩段式熱循環微流道PCR晶片，大同大學生物工程學系碩士論文，臺北。