臺灣博碩士論文加值系統

在生物樣品的製備與分析上，要使用MALDI-MS（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry）分析並且得到理想的圖譜，除鹽與濃縮是兩個很重要的樣品前處理步驟。本研究將離子液體基質（ionic liquid matrices）做另一個新穎的應用，即在進行MALDI-MS分析之前，先將離子液體基質CCA/3-AQ（α-Cyano-4-hydroxycinnamate/3-aminoquinoline）當作萃取溶劑，從水溶液中萃取、濃縮胜肽，萃取完成後可立即進行MALDI分析，不需再進行其他繁雜的樣品製備步驟。使用分散液相微萃取法（Dispersive liquid liquid microextraction, DLLME）和單滴微萃取 (Single drop microextraction, SDME) 的方式來達到小體積比 (CCA/3-AQ：水樣＝1 uL：40 uL) 或大體積比 (CCA/3-AQ：水樣＝1 uL：40 mL) 萃取胜肽的目的。結果顯示，使用CCA/3-AQ此種離子液體確實可以達到樣品預濃縮的目的。在萃取應用部分，在蛋白質消化過程中常加入的尿素、變性劑和高濃度的鹽類，均會干擾MALDI質譜的分析，利用CCA/3-AQ萃取蛋白質樣品消化後的胜肽，可以減少鹽類對質譜分析的干擾。

Sample preparation procedures such as desalting and concentration are key steps for a successful MALDI analysis of biological samples. A new approach of using ionic liquid matrix (ILM) α-cyano-4-hydroxycinnamate/3-aminoquinoline (CCA/3-AQ) as a solvent for the separation and preconcentration of peptides in aqueous samples prior to analysis by MALDI has been demonstrated. The samples were analyzed in-situ after the extraction without further sample transfer. Liquid liquid microextraction and single drop microextraction were employed for the extraction of peptides. MALDI analysis of protein digests in the presence of high concentration buffers and urea was investigated using CCA/3-AQ as a concentration solvent and a MALDI matrix.

摘要 i
Abstract ii
目錄 iii
1、緒論 1
1.1、前言 1
1.2、質譜儀的原理與發展 2
1.3、基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS） 5
1.4、離子液體 12
1.5、液體基質 14
1.6、液相微萃取法（liquid phase microextraction） 16
2、實驗 21
2.1、藥品 21
2.2、儀器 22
2.2.1、質譜儀 22
2.2.2、其他儀器 22
2.3、實驗流程 23
2.3.1、離子液體基質CCA/3-AQ的製備 23
2.3.2、製作單一胜肽Ang I的校正曲線 24
2.3.3、製作五種胜肽混合物的校正曲線 24
2.3.4、胜肽之離子液體/水的分佈係數測定 25
2.3.5、液相-液相微萃取法（liquid-liquid microextraction, LLME） 27
2.3.6、蛋白質以胰蛋白酶消化 30
3、結果與討論 33
3.1、以CCA/3-AQ為MALDI的液體基質 34
3.2、CCA/3-AQ在胜肽定量上的表現 36
3.3、胜肽之離子液體/水的分佈係數 38
3.4、萃取方式的選擇 45
3.5、萃取條件最佳化 48
3.5.1、 萃取時間 48
3.5.2. 離心速率與離心時間 50
3.5.3、萃取環境溫度 52
3.5.4、萃取環境pH值 54
3.6、CCA/3-AQ在胜肽混合物定量上的表現與萃取回收率 56
3.7、CCA/3-AQ在蛋白質消化樣品的萃取應用 62
4、結論 69
5、參考文獻 71

圖目錄
圖一、質譜儀組成簡圖。 2
圖二、MALDI 離子化示意圖。 7
圖三、MALDI 圖譜中分析物的分子離子（[M+H]+）以及[M+Na]+ 和[M+K]+的訊號。 8
圖四、基質輔助雷射脫附游離法-飛行時間質譜儀。 12
圖五、離子液體的分類。 16
圖六、直接單滴微萃取法。 19
圖七、中空纖維液相微萃取法。 19
圖八、分散液相微萃取法的實驗流程簡化圖。 19
圖九、CCA/3-AQ的結構。 23
圖十、兩種液相-液相微萃取法之實驗流程圖。 29
圖十一、Ang.I以離子液體基質CCA/3-AQ為基質，作偵測極限測試 (a)濃度為25 fmol (b)為15 fmol (c)為10 fmol。 35
圖十二、以0.5 pmol的Sub P為內標準品分別與 (a) 1 pmol (b) 0.5 pmol的Ang I混合的質譜圖(c)為10 fmol。 37
圖十三、以離子液體CCA/3-AQ為基質，將內標準品Sub. P與分析物Ang I 的濃度比對MALDI的訊號強度比作圖之校正曲線。 38
圖十四、以預先被水飽和過的離子液體CCA/3-AQ為基質，樣品水溶液為預先用離子液體基質CCA/3-AQ飽和過的水，將內標準品Sub. P與分析物Ang I 的濃度比對MALDI的訊號強度比作圖之校正曲線。
40
圖十五、以預先有（●）或沒有（■）被水飽和過的離子液體CCA/3-AQ為基質，0.5 pmol的Sub. P為內標準品對分析物Ang I之校正曲線比較。 41
圖十六、胜肽之離子液體/水的分佈係數測定。 42
圖十七、Ang I在7.5 nM的濃度下，於20 uL的樣品水溶液裡（a）直接取0.5 uL點在樣品盤上，利用固體基質CCA分析，和（b）經過0.5 uL 的CCA/3-AQ濃縮、萃取之後，直接分析CCA/3-AQ，的圖譜訊號差異比較。 43
圖十八、Ang.I於20 uL的樣品水溶液裡，以0.5 uL 的離子液體基質CCA/3-AQ濃縮、萃取之後，直接分析CCA/3-AQ，作偵測極限測試。濃度為（a）5 nM（b）2.5 nM（c）1.25 nM。 44
圖十九、2 uL離子液體基質CCA/3-AQ，在未加入疏水性溶液Quinoline前，以LLME方式的胜肽回收率與加入Quinoline後，以DLLME方式的胜肽回收率之比較。 47
圖二十、萃取時間與胜肽Ang I的萃取回收率之關係圖。 49
圖二十一、離心機轉速與胜肽Ang I的萃取回收率之關係圖。 51
圖二十二、離心時間與胜肽Ang I的萃取回收率之關係圖。 51
圖二十三、萃取環境溫度與胜肽Ang I的萃取回收率之關係圖。 53
圖二十四、萃取環境pH值與胜肽Ang I的萃取回收率之關係圖。 55
圖二十五、以0.5 pmol的Sub P為內標準品分別與 (a) 1 pmol (b) 0.5 pmol的五種胜肽混合物的質譜圖（基質為CCA/3-AQ）。 58
圖二十六、以0.5 pmol的Sub P為內標準品分別與五種胜肽混合物的濃度比對MALDI的訊號強度比作圖之校正曲線。 59
圖二十七、以1 uL的離子液體基質CCA/3-AQ萃取五種胜肽混合物的萃取回收率比較圖。 60
圖二十八、以離子液體基質CCA/3-AQ萃取水溶液中五種胜肽混合物的MALDI 質譜圖。 61
圖二十九、以離子液體CCA/3-AQ萃取蛋白質α-casein的消化產物之萃取濃度極限（a）5 nM（b）2.5 nM（c）1.25 nM。 64
圖三十、2 pmol的蛋白質α-casein在pH8.5 的 50 mM Tris-buffer裡消化16小時，在（a）使用離子液體CCA/3-AQ濃縮萃取前，取樣品水溶液以固體基質CCA分析和（b）經濃縮萃取後，直接分析CCA/3-AQ的MALDI圖譜比較。 65
圖三十一、 2 pmol的蛋白質α-casein消化16小時並加入100mM Guanidine thiocyanate，在（a）使用離子液體CCA/3-AQ濃縮萃取前，取樣品水溶液以固體基質CCA分析和(b)經濃縮萃取後，直接分析CCA/3-AQ的MALDI圖譜比較。 66
圖三十二、0.5 ug的蛋白質BSA消化16小時並加入3.6M的尿素，在（a）使用離子液體CCA/3-AQ濃縮萃取前，取樣品水溶液以固體基質CCA分析和(b)經濃縮萃取後，直接分析CCA/3-AQ的MALDI圖譜比較。 67
圖三十三、0.3 ug的蛋白質混合物BSA和α-casein裡消化16小時並加入3.6M的尿素，在（a）使用離子液體CCA/3-AQ濃縮萃取前，取樣品水溶液以固體基質CCA分析和(b)經濃縮萃取後，直接分析CCA/3-AQ的MALDI圖譜比較。 68

表目錄
表一、常用的MALDI基質之結構與其分子量。 9
表二、六種胜肽的分子量及其序列。 31
表三、六種混合胜肽的分子量。 57

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