臺灣博碩士論文加值系統

目前全世界吹起開發新替代能源的潮流，其生質柴油仍是開發主流之ㄧ，然而於快速發展趨勢之下，生質柴油的生產過程中其副產物為甘油(glycerol)，然而甘油附加價值較低，且萃取甘油技術耗成本及耗能源。因此，如何能夠將甘油轉換成高經濟產品，以提升生產生質柴油程序之品質，是一門十分值得研究的課題。本研究主要尋找菌株Klebsiella sp.將甘油轉換成具有更高經濟價值的1,3-丙二醇(1,3-propanediol; 1,3-PD)之最佳培養條件。首先以本土菌株Klebsiella sp.針對好氧、微氧及厭氧環境探討，以微氧培養環境之下為最佳，且發現1,3-PD產物為生長相關型產物。進而於不同碳源濃度之下，伴隨著提升碳源濃度，其1,3-PD亦有提升之趨勢現象產生，其1,3-PD轉化率可高達58%，但當碳源濃度過量時，則呈現出抑制菌體生長之現象，以導致抑制1,3-PD之生產而降低轉化率。然而於初始時，以不同碳源種類儲菌馴養之下，對轉化1,3-PD亦會造成影響。最後，期望經由添加固態菌體吸附劑提升生產1,3-PD最大產量，同時以重複培養的方式冀以在延長反應時間的情況下，維持、甚至是提升1,3-PDO的最大產量，進而提升高經濟產物的量，並增加甘油除化妝品以外之應用性，以提升生產生質柴油程序再經濟化之可行性。

In the biodiesel production process, glycerol is produced as a byproduct. With the increasing demand of biodiesel, the byproduct glycerol generation will be increased as a consequence. In order to enhance the value of glycerol, value-added products derived from glycerol should be explored. In this study, Klebsiella sp. is used to convert glycerol into 1,3-propanediol (1,3-PDO), a valuable monomer used to produce polymer –polytrimethylene terphthalate (PTT). The favorable incubating condition of Klebsiella sp. for 1,3-PDO production is as found to be at 30oC and shaking speed of 200 rpm. Also glycerol used in strain preservation medium was essential for 1,3-PDO production. In addition, 1,3-propanediol was found to be a growth-associated product and the yield of 0.58 (1,3-PDO/glycerol) was achived. An optimal incubation condition (37oC and 535.3 mM glycerol) for 1,3-PDO production was abtained by using response surface methodology (RSM). The highest concentration of 1,3-PDO was obtained 346.4 mM with the yield of 0.65.

中文摘要……………………………………………………………………………Ⅰ目錄…………………………………………………………………………………Ⅱ
圖目錄………………………………………………………………………………Ⅳ
表目錄……………………………………………………………………………Ⅵ


第一章 前言………………………………………………………………………1

第二章 文獻回顧…………………………………………………………………3

2.1 生物精煉與生質能源………………………………………………………3
2.1.1 生物精煉………………………………………………………………3
2.1.2生質能源……………………………………………………………6
2.1.2.1 生質能源技術………………………………………………6
2.1.2.2 生質柴油……………………………………………………7
2.3 1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PPD, 1,3-PDO)……………………………9
2.3.1 1,3-propanediol的製程………………………………………………11
2.3.1.1 化學法………………………………………………………11
2.3.1.2 生物法………………………………………………………12
2.4 Glycerol Dehydratase與1,3-Propanediol Oxidoreductase…………………16
2.4.1 Glycerol Dehydratase…………………………………………………16
2.4.2 1,3-Propanediol Oxidoreductase……………………………………17
2.5 Response Surface Methodology (RSM) ……………………………………18

第三章 實驗材料與方法……………………………………………………………22

3.1實驗藥品……………………………………………………………………22
3.2實驗菌株介紹………………………………………………………………23
3.3實驗儀器……………………………………………………………………24
3.3.1常規實驗儀器設備……………………………………………………24
3.3.2 純菌Klebsiella sp.產1,3-propanediol之實驗儀器…………………24
3.4分析儀器及方法………………………………………………………………24
3.4.1液相代謝產物組成分析………………………………………………24
3.4.2菌量測定………………………………………………………………25
3.5以Klebsiella sp. 轉化甘油為1,3-丙二醇……………………………………26
3.5.1液相代謝產物組成分析………………………………………………26
3.5.1.1儲菌營養基質成分……………………………………………26
3.5.1.2前培養營養基質成分…………………………………………27
3.5.1.3醱酵營養基質成分……………………………………………28
3.5.2 1,3-PDO的產生………………………………………………………28
3.5.2.1 Klebsiella sp. 產1,3-PDO……………………………………28
3.5.2.2 氧氣有無對產1,3-PDO的影響………………………………29
3.5.3 儲菌碳源對1,3-PDO產量的影響………………………………29
3.5.4轉速及氣體流通對1,3-PDO產量的影響…………………………30
3.5.5 以Two-Level Design及陡升法找尋最佳條件………………………30
3.5.5.1 Two-Level Design……………………………………………30
3.5.5.2利用陡升法逼近所需求的條件………………………………31
3.5.6 添加菌體吸附之顆粒及重複培養對1,3-PDO產量影響……………32

第四章 結果與討論………………………………………………………………36

4.1 1,3-PDO的產生………………………………………………………36
4.1.1 Klebsiella sp. 產1,3-PDO……………………………………………36
4.1.2氧氣有無對產1,3-PDO的影響………………………………………39
4.2儲菌碳源對1,3-PDO產量的影響…………………………………………43
4.3 轉速及氣體流通對1,3-PDO產量的影響……………………………………45
4.4以Two-Level Design及陡升法找尋最佳條件………………………………48
4.5添加菌體吸附之顆粒及重複培養對1,3-PDO產量影響……………………58
4.6副產物與1,3-PDO的關係……………………………………………………73

第五章 結論………………………………………………………………………76

附錄(Appendix)……………………………………………………………………78
App.5探討添加顆粒及重複植菌對1,3-PDO產量影響…………………………78
App.5.1 第一次實驗（各批次間未調控初始pH值）……………………………78
App.5.2 第二次實驗（各批次間有調控初始pH值）……………………………85

參考文獻……………………………………………………………………………92





圖目錄
圖2.1美國目前發展生物精煉概念……………………………………………3
圖 2.2 新世紀再生能源-生質柴油………………………………………………8
圖 2.3 甘油結構式…………………………………………………………………9
圖 2.4 1,3-PDO的結構式…………………………………………………………10
圖 2.5 化學法生產1,3-PDO……………………………………………………11
圖 2.6 杜邦生成1,3-PDO的方法…………………………………………………12
圖 2.7 微生物代謝甘油路徑……………………………………………………13
圖 2.8 甘油代謝路徑及所需酵素………………………………………………16
圖 2.9 Glycerol dehydratase 催化反應…………………………………………17
圖 4.1 利用儲菌培養基通入氬氣進行厭氧醱酵………………………………37
圖 4.2 生物代謝甘油的路徑圖…………………………………………………38
圖 4.3 利用儲菌培養基通入空氣進行醱酵………………………………………40
圖 4.4利用儲菌培養基通入純氧進行醱酵………………………………………41
圖 4.5 儲菌碳源種類對1,3-PDO產量的影響……………………………………44
圖 4.6 儲菌碳源種類對菌體濃度的影響………………………………………44
圖 4.7 轉速對OD600及[1,3-PDO]的影響…………………………………………46
圖 4.8 氣體流通對菌體濃度及1,3-PDO產量的影響……………………………47
圖 4.9 生物代謝甘油的路徑圖……………………………………………………49
圖 4.10 第一次陡升法結果圖……………………………………………………53
圖 4.11 第二次陡升法結果圖……………………………………………………55
圖 4.12 結合第一次陡升法及第二次陡升法的結果關係圖……………………55
圖 4.13 第二次陡升法的產率結果圖……………………………………………57
圖 4.14 第二次陡升法1,3-PDO的生成關係圖…………………………………57

圖 4.15 第一次實驗添加發泡煉石對菌體濃度的影響…………………………60
圖 4.16 第一次實驗添加發泡煉石對[1,3PDO]的影響…………………………60
圖 4.17 第一次實驗添加活性炭對[1,3PDO]的影響……………………………61
圖 4.18 第二次實驗添加發泡煉石對菌體濃度的影響…………………………61
圖 4.19 第二次實驗添加發泡煉石對[1,3PDO]的影響…………………………62
圖 4.20 第一次實驗添加活性炭對各批次間初始pH值的影響………………62
圖 4.21 第一次實驗添加發泡煉石對各批次間初始pH值的影響……………63
圖 4.22 第二次實驗添加活性炭對[1,3PDO]的影響……………………………67
圖 4.23 Two-Level Design中的第六組實驗…………………………………74
圖 4.24 第二次陡升法中第二組實驗……………………………………………75
圖 A-1添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (1)……………78
圖 A-2添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (2)……………79
圖 A-3 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (3)……………80
圖 A-4 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (4)……………81
圖 A-5 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (5)……………82
圖 A-6 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (6)……………83
圖 A-7 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次） (7)……………84
圖 A-8 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (1)……………85
圖 A-9 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (2)……………86
圖 A-10 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (3)……………87
圖 A-11 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (4)……………88
圖 A-12 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (5)……………89
圖 A-13 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (6)……………90
圖 A-14 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次） (7)……………91


表目錄
Table 2-1 生物精煉技術平台………………………………………………………5
Table 3-1 Two-Level Design各組實驗的操作條件…………………………31, 49
Table 3-2 第一次陡升法…………………………………………………………32
Table 3-3 第二次陡升法…………………………………………………………32
Table 3-4 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次）第一批次……34
Table 3-5 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次）第二批次……34
Table 3-6 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第一次）第三批次……34
Table 3-7 添加固態菌體吸附劑並結合重複培養實驗（第二次）………………35
Table 4-1氧氣有無對產1,3-PDO的影響…………………………………………42
Table 4-2 Two-Level Design 結果關係表（一）…………………………………51
Table 4-3 Two-Level Design 結果關係表（二）…………………………………51
Table 4-4 Two-Level Design結果…………………………………………………52
Table 4-5 第一次陡升法條件與結果………………………………………………54
Table 4-6 第二次陡升法條件與結果………………………………………………54
Table 4-7 第一次添加固態吸附劑實驗—第一批次………………………………63
Table 4-8 第一次添加固態吸附劑實驗—第二批次………………………………64
Table 4-9 第一次添加固態吸附劑實驗—第三批次………………………………64
Table 4-10 第一次添加固態吸附劑實驗—添加活性炭顆粒……………………65
Table 4-11第一次添加固態吸附劑實驗—添加發泡煉石………………………65
Table 4-12 第一次添加固態吸附劑實驗—無添加固態吸附顆粒………………66
Table 4-13 第二次添加固態吸附劑實驗—第一批次……………………………68
Table 4-14 第二次添加固態吸附劑實驗—第二批次……………………………68
Table 4-15 第二次添加固態吸附劑實驗—第三批次……………………………69
Table 4-16 第二次添加固態吸附劑實驗—添加活性炭顆粒……………………69
Table 4-17 第二次添加固態吸附劑實驗—添加發泡煉石………………………70
Table 4-18 第二次添加固態吸附劑實驗—無添加固態吸附顆粒………………70
Table 4-19第一次實驗的最大生成速率…………………………………………72

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