臺灣博碩士論文加值系統

B染色體 (B-chromosome) 又稱為超數染色體 (supernumerary chromosome)，是指在個體中所帶有不屬於正常染色體 (A chromosomes) 之非必要的額外染色體。玉米B染色體為末端中節染色體，其長臂可以細分為近端異染色質 (proximal heterochromatin)、近端常染色質 (proximal euchromatin)、遠端異染色質 (distal heterochromatin) 及遠端常染色質 (distal euchromatin)。玉米B染色體的DNA組成與A染色體相似，因此造成玉米B染色體的研究困難，目前僅發現三個玉米B染色體專一序列 (ZmBs、CL-repeat及StarkB)。本研究對四個B染色體專一性RAPD (random amplification of polymorphic DNA) 標誌進行選殖與分析，序列分析結果顯示其中兩個序列與逆轉位子 (retrotransposon) 的序列相關，另外二個序列則與玉米A染色體具有同源性。南方雜合分析 (Southern hybridization) 結果顯示此四個B染色體序列皆為重覆性序列。接著將四個B染色體專一性RAPD標誌轉換成SCAR (sequence characterized amplified region) 分子標誌，再以位於B染色體上不同斷裂點的B-10L易位染色體 (translocation)，進行B染色體專一性SCAR分子標誌之實體定位，結果顯示四個B染色體專一性SCAR標誌皆位於異染色質區。螢光原位雜合分析 (fluorescence in situ hybridization) 顯示四個B染色體專一性RAPD序列在A染色體和B染色體中皆有訊號，在B染色體上的訊號集中於異染色質區域。最後應用此四個B染色體專一性SCAR標誌將帶CL-repeat的基因組片段定位於B染色體特定區域內。

The B-chromosome also called supernumerary chromosome is an extra or nonessential chromosomes that is not a member of the basic A chromosomes in individuals. The maize B-chromosome is a telocentric and it’s long arm consists of a proximal heterochromatic region, a proximal euchromatic region, a distal heterochromatic region and a distal ecchromatic tip. Isolation of sequences from the B-chromosome is always difficult, owing to that the DNA composition is similar between A and B chromosomes. Only three B-specific sequences (ZmBs, CL-repeat, and StarkB) are identified in maize until now. In this study, we cloned and analyzed four B-specific RAPD (random amplification of polymorphic DNA) markers. Sequences alignment showed that two sequences had homology with retrotransposons in maize, and others had homology to A chromosomes. Southern hybridization analysis indicated that the four B-specific RAPD markers were repetitive sequences. Subsequently, the four B-specific RAPD markers were converted into SCAR (sequence characterized amplified region) markers. Physical mapping of the four B-specific SCAR markers by B-10L translocations with different breakpoints in the B-chromosome, indicating that the four B-specific SCAR markers located on the distal heterochromatic region. By fluorescence in situ hybridization, signals of the four B-specific RAPD sequences were observed in A and B chromosomes, and concentrated on the distal heterochromatic region of the B-chromosome. Finally, these four B-specific SCAR markers were further applied to map the CL-repeat-carrying-genomic fragments onto definte regions of the B-chromosome.

目次
摘要 i
Abstract ii
目次 iii
表目次 vi
圖目次 vii
第一章、前言 1
第二章、前人研究 2
一、 B染色體概論 2
二、 B染色體的細胞學形態 2
三、 B染色體的遺傳特性 3
四、 B染色體的組成結構 4
五、 B染色體專一性序列 5
六、 B-A易位染色體 7
七、 B染色體上的分子標誌 8
第三章、材料方法 10
一、 玉米材料 10
二、 B-A易位染色體材料之產生與鑑定 10
(一) B-10L易位染色體材料 10
(二) 其他B-A易位染色體材料 11
(三) 易位異質結合體、三級三染體及亞倍體之產生 11
(四) 根尖染色體數目之鑑定 12
三、 帶有CL-repeat基因組片段 (clones) 12
四、 植物基因組DNA之萃取 13
(一) 小量植物基因組DNA之萃取 13
(二) 中量植物基因組DNA之萃取 13
五、 逢機增幅多型性核酸 (random amplification of polymorphic DNA, RAPD) 與電泳分析 14
(一) RAPD 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 14
(二) 洋菜膠體電泳分析 14
六、 RAPD 片段回收 15
七、 DNA片段的選殖 15
(一) 黏接作用 (ligation) 15
(二) 製備勝任細胞 (competent cell) 15
(三) 轉形作用 (transformation) 16
(四) 快速篩選 (rapid screening) 選殖質體DNA 16
八、 質體DNA之萃取 16
(一) 質體DNA萃取 16
九、 具目標片段的菌落之篩選 17
(一) 聚合酶連鎖反應 17
(二) 限制酵素剪切 17
十、 DNA序列定序、分析及註冊 17
十一、 序列特異性增幅區間 (sequence characterized amplified region, SCAR) 分子標誌 18
(一) SCAR分子標誌引子設計 18
(二) SCAR-PCR 18
十二、 南方雜合分析 19
(一) 基因組DNA之純化 19
(二) 限制酵素剪切與轉漬 19
(三) 探針DNA的PCR增幅之純化 20
(四) 製備雜合探針 20
(五) Sephadex G-50純化管柱之製作 20
(六) 雜合反應 (Hybridization) 21
(七) 非專一性探針之去除 (Wash) 21
(八) 影像掃描 21
(九) 專一性探針之除去 (Stripping) 22
十三、 螢光原位雜合反應 (Fluorescence in situ hybridization, FISH) 22
(一) 製備根尖細胞染色體 22
(二) 製備粗絲期染色體 22
(三) 探針之製備 23
(四) 探針之變性 23
(五) 原位雜合 24
(六) 洗去非專一性探針和螢光訊號之觀察 24
(七) 探針訊號之擷取 25
第四章、結果 26
一、 B染色體專一性RAPD片段的增幅、回收及選殖 26
二、 B染色體專一性RAPD序列分析和註冊 27
三、 SCAR標誌之轉換與篩選 28
四、 以B-10L易位染色體進行實體定位 29
五、 其他B-A易位染色體的實體定位 31
六、 B染色體專一性RAPD標誌之南方雜合分析 32
(一) 單一種限制酵素剪切之分析 32
(二) 二種不同限制酵素剪切之分析 33
七、 B染色體專一性SCAR標誌之南方雜合分析 34
八、 螢光原位雜合分析 34
(一) 根尖有絲分裂中期染色體分析 34
(二) 減數分裂粗絲期B染色體分析 35
九、 以SCAR標誌定位帶CL-repeat基因組片段 35
第五章、討論 37
一、 RAPD標誌的不穩定 37
二、 B染色體專一性SCAR標誌之轉換 37
三、 四個B染色體專一性SCAR標誌與易位染色體相互實體定位 38
四、 B-A易位染色體實體定位之整合 40
五、 B染色體專一性RAPD標誌之序列特性 41
六、 B染色體專一性SCAR標誌的實際應用 43
七、 總結 44
第六章、參考文獻 45

表目次
表 一、四個B染色體專一性RAPD標誌之引子序列與主要增幅條帶 48
表 二、四個B染色體專一性RAPD標誌之序列特性分析與比對 49
表 三、SCAR-PCR分析使用之引子和序列 50
表 四、可增幅出B染色體專一性條帶之SCAR引子組合和片段大小 51
表 五、B染色體專一性SCAR標誌以十七組B-10L易位染色體異型結合體、三級三染體及亞倍體增幅結果和實體定位 52
表 六、B染色體專一性SCAR標誌以四組B-A易位染色體增幅結果和實體定位 53
表 七、四個B染色體專一性標誌南方雜合分析之特性 54
表 八、四個B染色體專一性序列於粗絲期B染色體螢光雜合分析 55
表 九、以B染色體專一性SCAR標誌增幅三十一個帶CL-repeat基因組片段 56

圖目次
圖 一、 玉米B染色體、易位異質結合體、三級三染體及亞倍體的細胞學結構 57
圖 二、 四個B染色體專一性RAPD標誌之PCR增幅結果 58
圖 三、 B染色體專一性RAPD標誌成功選殖之篩選 59
圖 四、 四個B染色體專一性RPAD標誌之序列比對分析 60
圖 五、 SCAR 引子在四個B染色體專一性RAPD序列上之位置 61
圖 六、 B染色體專一性SCAR引子組合篩選 62
圖 七、 十七個B-10L易位染色體位於B染色體上之斷裂點 64
圖 八、 以十七個玉米B-10L易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR 313 L1/R1標誌 65
圖 九、 以十七個玉米B-10L易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR 345 L1/R1標誌 66
圖 十、 以十七個玉米B-10L易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR 349 L2/R2標誌 67
圖 十一、 以十七個玉米B-10L易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR 426 L2/R1標誌 68
圖 十二、 四個B染色體專一性RAPD標誌在B染色體上分佈 69
圖 十三、 以四個B-A易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR 313 標誌L1/R1 70
圖 十四、 以四個B-A易位染色體實體定位B染色體專一性SCAR標誌 71
圖 十五、 以四個B-A易位染色體定位四個B染色體專一性RAPDS標誌在B染色體上分佈 72
圖 十六、 B染色體專一性RAPD標誌之南方雜合分析 (單一酵素剪切) 73
圖 十七、 B染色體專一性RAPD標誌於南方雜合分析 (二種酵素剪切) 74
圖 十八、 B染色體專一性SCAR 313 L4/R1標誌之南方雜合分析 75
圖 十九、 B染色體專一性SCAR 313 L2/R2標誌之南方雜合分析 76
圖 二十、 B染色體專一性SCAR 345 L1/R1標誌之南方雜合分析 77
圖 二十一、 B染色體專一性SCAR 349 L1/R1標誌之南方雜合分析 78
圖 二十二、 B染色體專一性SCAR 426 L1/R1標誌之南方雜合分析 79
圖 二十三、 四個B染色體專一性RAPDS於有絲分裂中期染色體螢光原位雜合分析結果 80
圖 二十四、 四個B染色體專一性RAPDS於粗絲期B染色體螢光原位雜合分析結果 81
圖 二十五、 以SCAR 313 L1/R1標誌分析31個帶CL-repeat 基因組片段 82
圖 二十六、 以SCAR 426 L1/R2標誌分析31個帶CL-repeat 基因組片段 83
圖 二十七、 以B染色體專一性SCAR標誌定位帶CL-repeat基因組片段 84
圖 二十八、 以21個B-A易位染色體實體定位四個B染色體專一性RAPD標誌之分佈模式圖 85
圖 二十九、 B-10L易位染色體在B染色體上斷裂點 86

附圖 一、 B-10L易位染色體雜交流程圖 87
附圖 二、 TB-4SA易位染色體雜交流程圖 88

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