臺灣博碩士論文加值系統

腫瘤微環境由許多不同種類的細胞形成。在這些不同的細胞中，我們將研究焦點放在癌細胞與癌相關纖維母細胞之交互作用，以及在腫瘤微環境中，因為癌細胞與血管細胞、免疫細胞等在細胞因子上的刺激，造成血管的通透性相較於正常細胞而有所改變，造成在環境中的間質液壓產生變化。在實驗中，我們使用的細胞是人類肺腺癌細胞(CL1-0)人類肺部纖維母細胞(MRC-5)。我們以實驗室所設計之壓力晶片進行測試，以20 mmHg、30 mmHg、40 mmHg的靜水壓模擬腫瘤中的間質液壓並且利用所設計晶片上細胞因子免疫螢光分析法的結果與一般生物研究中常使用於測定細胞因子的酵素連結免疫吸附法(ELISA)之結果做為比較。
使用晶片上細胞因子免疫螢光分析法相較於使用酵素連結免疫吸附法，所使用的樣品量少，若要同時測定多種細胞因子時，其時間成本相較為低，可以作為一種即時性測定的初步判斷依據。
在使用CL1-0肺癌細胞之條件式培養液對纖維母細胞的影響的實驗中，我們可由酵素連結免疫吸附法的結果中得知在IL-6的表現量有下降的趨勢存在，但沒有顯著差異；另外，在cytokine immunofluorescence assay (CIFA) Chip的結果顯示了相同的趨勢。
在靜水壓力實驗中，人類纖維母細胞(MRC-5)受壓力刺激的情況下，我們選定幾種MRC-5會分泌的細胞因子作為目標測定因子。在我們的結果中顯示：我們從酵素連結免疫吸附法的結果可以得知其在IL-6、IL-8、HGF以及IGF-I，沒有呈現顯著的差異。另外，在CIFA Chip的結果也顯示相同的趨勢。
綜合以上所述，我們可以使用晶片上細胞因子免疫螢光分析法作為一種即時判斷的測試方法，在未來我們可以提高此法的鑑測精度，以及增加可同時檢測之細胞因子的種類。

The tumor microenvironment composes of several types of cells. In these different cell types, our research would focus on the interactions between cancer cells and cancer associate fibroblasts. In addition, because of the interaction between cancer cell with vessel and immune cell by cytokine, the interaction leads the vessel permeability has significant difference with normal cells. To determent the affection from interstitial fluid pressure, our laboratory designed a cell culture device capable of producing hydrostatic pressure of 20 mmHg, 30 mmHg, and 40 mmHg, simulating the interstitial fluid pressure in tumors. Furthermore, we compared the result of cytokine immunofluorescence assay with regular ELISA assays. The advantage of using cytokine immuno- fluorescence assay (CIFA) including few sample quantities and the time on testing several cytokine is relatively short.
By stimulating the human lung fibroblast MRC-5 with the condition medium (CM) of human lung cancer cell CL1-0, the secretions from MRC-5 seemed to be reduced. In addition, the result from CIFA also show the same tendency. In the hydrostatic pressure experiment, the secretion of fibroblasts did not show a remarkable difference in IL6, IL8, HGF and IGF-I. The results from CIFA also showed the same tendency.

目錄
致謝 I
中文摘要 II
ABSTRACT III
目錄 IV
圖目錄 VI
表目錄 VII
第一章 研究背景與動機 1
1.1 腫瘤微環境(TUMOR MICROENVIRONMENT) 2
1.2 癌相關纖維母細胞（CAFS）對於癌細胞之影響 3
1.3 間質液壓對於癌細胞與纖維母細胞之影響 5
1.4 研究動機 7
第二章 靜水壓實驗裝置製程與細胞因子免疫螢光分析晶片設計 8
2.1 靜水壓實驗裝置 8
2.2 細胞因子免疫螢光分析晶片設計 10
2.3 免疫螢光分析晶片（CIFA上蓋）製程 12
2.3.1 壓克力（PMMA）夾具製作流程 14
2.3.2 微製程流程與軟微影技術（Soft lithography） 15
2.3.3 免疫螢光分析晶片（下方培養區）製作流程 19
第三章 系統架設與實驗方法 20
3.1 細胞株與細胞培養 20
3.2 細胞因子免疫螢光分析晶片(CIFA CHIP)實驗流程 21
3.3 壓力實驗流程 23
3.4 酵素連結免疫吸附法(ELISA)流程 24
第四章 實驗結果與討論 27
4.1 晶片上細胞因子免疫螢光分析法(CIFA CHIP)校正 27
4.2癌相關纖維母細胞與正常纖維母細胞之細胞因子變化 33
4.3 靜水壓對於纖維母細胞之細胞因子影響 39
第五章 結論與未來展望 43
5.1 實驗總結 43
5.2 未來展望 43
參考文獻 44
附錄 A 46

圖目錄
圖1 106年十大癌症死因死亡率 4
圖2 腫瘤微環境結構示意圖 5
圖3 癌相關纖維母細胞(CAFs)與腫瘤微環境中細胞群之交互作用示意圖 6
圖4 癌相關纖維母細胞(CAFs)與常的纖維母細胞、肺癌細胞有著TGF-β1的循環示意圖 8
圖5 在肺癌細胞中的升高的靜水壓誘導的遷移的加速和體積膨脹之機制 9
圖6 靜水壓力裝置結構示意圖 12
圖7集成血液條形碼芯片(Integrated Blood Barcode Chip, IBBC)示意圖 13
圖8 使用AutoCAD繪製之光罩設計圖 14
圖9 使用AutoCAD繪製之夾具設計圖 17
圖10 spinner在各不同光阻塗布下之轉速與厚度關係圖 21
圖11 免疫螢光分析晶片（下方培養區）裝置結構示意圖 22
圖12 常見的ELISA原理 27
圖13 HGF標準品濃度與螢光強度曲線圖。 31
圖14 HGF標準品濃度與螢光強度在同一條流道不同Chip之分佈圖 32
圖15 IL8標準品濃度與螢光強度在同一條流道不同Chip之分佈圖 34
圖16 IL6標準品濃度與螢光強度在同一條流道不同Chip之分佈圖 36
圖17 製備人類肺腺癌細胞CL1-0的條件式培養基步驟。 37
圖18 CIFA Chip螢光圖結果。 37
圖19 HGF之ELISA測試結果。 38
圖20 HGF之CIFA Chip測試結果與CIFA Chip和ELISA對控制變因(CTL)之歸一化比較圖。 39
圖21 IL8之ELISA測試結果。 40
圖22 IL8之CIFA Chip測試結果與CIFA Chip和ELISA對控制變因(CTL)之歸一化比較圖。 41
圖23 IL 6之ELISA測試結果。 41
圖24 IL6之CIFA Chip測試結果與CIFA Chip和ELISA對控制變因(CTL)之歸一化比較圖。 42
圖25 以壓力作為物理性刺激對於人類纖維母細胞之影響的實驗流程。 43
圖26 ELISA測試結果，在以0 mmHg(control)到40 mmHg靜水壓作為刺激條件的實驗結果。 44
圖27 CIFA Chip測試結果，在以0 mmHg(control)與20 mmHg靜水壓作為刺激條件的實驗結果。 45
圖28 CIFA Chip與ELISA的測試結果，在以靜水壓0 mmHg、20 mmHg作為刺激條件對控制變因CTL之歸一化圖形。 45

表目錄
表 1 不同光阻之軟烤時間參數表 19
表2 不同光阻之曝光強度參數表 19
表3 不同光阻之曝後烤參數表 20
表4 各實驗之細胞培養條件一覽表 24
表5 各次實驗中HGF標準品螢光強度之相對標準差與HGF之設計平均相對標準差。 32
表6 各次實驗中IL8標準品螢光強度之相對標準差與IL8之設計平均相對標準差。 33
表7 各次實驗中IL8標準品螢光強度之相對標準差與IL8之設計平均相對標準差。 34
表8 各次實驗中IL6標準品螢光強度之相對標準差與IL6之設計平均相對標準差。 35
表9 各次實驗中IL6標準品螢光強度之相對標準差與IL6之設計平均相對標準差。 35
表10 HGF、IL8、IL6標準品螢光強度之設計平均相對標準差與FLOW2~4的製程平均相對標準差。 36

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