臺灣博碩士論文加值系統

松乳菇(Lactarius deliciosus)又名松樹蘑，是乳菇屬中最常見的大型蘑菇之一。在中國，主要分佈於長江中下游以及沿海地區。松乳菇多醣經文獻指出具有抑制腫瘤、抗菌等作用。多醣的生成會受到外在環境的影響，如溫度及光照或破壞菌體表面等，皆會刺激菌體產生多醣保護自己，因此本實驗想透過此特性來刺激松乳菇菌絲體產生胞外多醣。
本研究先以培養條件(溫度、轉速)的不同，篩選最適合松乳菇產生胞外多醣的環境，再利用物理條件的刺激：添加乙醇及沙拉油來誘導胞外多醣的生成，並分析其胞外多醣含量及分子量的變化。研究結果顯示：在培養溫度篩選的部分，其胞外多醣含量由多到少分別為23℃(238.08mg/ml)＞29℃(233.16mg/ml)＞26℃(214.83mg/ml)＞20℃(188.47mg/ml)，由此可發現，低溫和高溫相較之下低溫能產生較多的胞外多醣，表示低溫能有效刺激松乳菇胞外多醣的生成；而添加不同濃度(1.2%、2.4%、3.6%、4.5%)乙醇刺激松菇產胞外多醣，其胞外多醣含量由多到少分別為3.6% (15.78mg/ml)＞2.4% (14.6mg/ml)＞1.2% (13.98mg/ml)＞4.5% (12.14mg/ml)；培養天數對松乳菇產胞外多醣的影響以菌絲生長中、後期有明顯的變化。在分子量方面，在培養初期添加不同濃度乙醇對松乳菇大分子胞外多醣的生成效果最為明顯，分子量為1.345×106 Da其相對多醣含量由多到少分別為：2.4% (948mg/ml)＞3.6% (372mg/ml)＞4.5% (332mg/ml)＞1.2% (70mg/ml)，在分子量分布上2.210×105 Da左右的多醣體也有增加的趨勢，甚至生成新分子多醣( 1.96×103 Da )。在培養中、後期，1.345×106 Da多醣逐漸減少甚至消失；因此在第0天添加2.4%乙醇對松乳菇產胞外多醣的影響最為明顯，與控制組相比約增加54倍。添加不同劑量( 0.1ml、0.5ml、1ml )沙拉油，在培養初期對松乳菇產胞外多醣影響最為明顯，其胞外多醣含量分別為0.1ml (17.59mg/ml)＞0.5ml (15.56mg/ml)＞1ml (12.41mg/ml)，但在分子量分布上，無論在菌絲生長前、中、後期，1.345×106 Da左右的多醣體皆有明顯增加，而小分子多醣在9.612×104 Da ~ 1.96×103 Da左右也有增加的趨勢，其中在第0天添加0.5ml沙拉油對大分子多醣生成有最佳的效果，與控制組相比約增加約65倍。經兩階段刺激，松乳菇胞外多醣的產量有明顯的提升，但在分子量的分布上，大分子多醣在經過兩階段刺激後與單一刺激相比並沒有明顯的提升。

關鍵字：松乳菇、胞外多醣、乙醇、沙拉油

Lactarius deliciosus, also known as pine mushroom, is one of the most common large mushrooms in the genus Lactarius. In China, it is mainly distributed in the middle and down streams of the Yangtze River and coastal areas. The polysaccharide of Lactarius deliciosus has been shown to have tumor growth inhibitory and antibacterial activity. The production of polysaccharides is to be affected by the external environment, such as temperature and light or cell membrane damage, which will stimulate the cells to produce polysaccharides. Therefore, the purpose of this experiment is to stimulate the production of L. deliciosus extracellular polysaccharides.
Firstly, in this study, we screened the suitable environmental conditions for the production of extracellular polysaccharides from Lactarius deliciosus , and then stimulated by physical conditions: such as adding ethanol and cooking oil to induce the formation of extracellular polysaccharides. The results showed that the mycelia cultured at low temperature can produce more extracellular polysaccharides than those cultured at high temperatures. Secondly, adding different concentrations of ethanol stimulates the extracellular polysaccharide produced by the mushroom. In terms of molecular weight, the addition of ethanol at the beginning of the culture has the most significant effect on the formation of the macromolecular extracellular polysaccharide of L.deliciosus. Addition of 2.4 % ethanol had the greatest effect on the extracellular polysaccharide yield of L .deliciosus, which was about 54 times higher than that of the control.
Above all, after using two-stage stimulation, the production of extracellular polysaccharide was significantly increased, but on the other hand, the molecular weight distribution, the macromolecular polysaccharide was not significantly changed as compared to the single-stage stimulation.Furthermore,in terms of molecular weight,
the addition of ethanol at the early stage of the culture has the most significant effect on the formation of the macromolecular extracellular polysaccharide of L.deliciosus.


Keywords: L.deliciosus, extracellular polysaccharide, ethanol, cooking oil

摘要
目次…………………………………………………….…..………….…………….. I
圖目錄………………………........................…………………………..………….. III
表目錄………………………………………………………………………..……...IV
第一章 緒論………..………………………………………………………………..1
1.1前言……………………………………………………………………………1
第二章 文獻探討……………………………..……………………………………..3
2.1松乳菇簡介……………………………………………………………………3
2.1.1松乳菇分佈……………………………………………………………….3
2.1.2松乳菇子實體型態……………………………………………………….3
2.1.3菌絲體型態...............................................................4
2.2松乳菇藥理活性成分分析……………………………………………………4
2.2.1抗菌活性………………………………………………………………….4
2.2.2抗腫瘤活性……………………………………………………………….4
2.3松乳菇活性成分分析…………………………………………………………5
2.3.1微量元素………………………………………………………………….5
2.3.2胞外多醣………………………………………………………………….6
2.3.2.1多醣主要功用………………………………………………………..6
2.3.2.2多醣分子量分類……………………………………………………..7
2.3.3松乳菇多醣……………………………………………………………….7
2.4影響松乳菇菌絲體生成因子…………………………………………………8
2.4.1不同培養溫度對菌絲生長的比較研究………………………………….8
2.4.2不同光照強度對菌絲生長的影響……………………………………….8
2.4.3礦物質元素對菌絲生長的影響………………………………………….9
2.5影響松乳菇胞外多醣生成因子…………………………………………..…..9
第三章 研究動機與目的…………………………………………………………..11
第四章 材料與方法………………………………………………………………..12
4.1實驗架構……………………………………………………………………..12
4.2實驗材料……………………………………………………………………..13
4.2.1菌種……………………………………………………………………...13
4.2.2培養基配方……………………………………………………...………13
4.2.3藥品………………………………………………………..………….…13
4.2.4儀器設備…………………………………………………………...……14
4.3實驗方法……………………………………………………………………..15
4.3.1菌種培養、保存……………………………………………………........15
4.3.1.1松乳菇平盤培養………………………………………………….....15
4.3.1.2松乳菇液態醱酵…………………………………………………….15
4.3.1.3菌種保存…………………………………………………………….15
4.3.2松乳菇胞外多醣液態醱酵培養…………………………………………16
4.3.2.1不同轉速及溫度對松乳菇液態醱酵胞外多醣生成之影響.............16
4.3.2.1.1松乳菇以轉速120rpm及不同溫度液態醱酵培養14天..........16
4.3.2.1.2松乳菇以轉速150rpm及不同溫度液態醱酵培養14天..........16
4.3.2.2第0、5、10天添加不同劑量且不同濃度乙醇對松乳菇液態醱酵胞
外多醣生成之影響………………………………………….……….16
4.3.2.2.1第0、5、10天添加5ml不同濃度乙醇對松乳菇胞外多醣生成之影響……………………………….16
4.3.2.3第0、5、10天添加不同劑量沙拉油對松乳菇液態醱酵胞外多醣之
影響…........................................17
4.3.2.4兩階段刺激培養對松乳菇胞外多醣之影響…………………….….17
4.3.3樣品代號………………………………………………………………….17
4.3.4松乳菇多醣分析……………...…………………………………………..18
4.3.4.1總醣量測定…………………………………………………………..19
4.3.4.1.1標準曲線製定…………………….………………………….….19
4.3.4.1.2總多醣含量測定步驟……………………………………….…..19
4.3.4.2 DNS還原醣測定………………………………………………….…20
4.3.4.2.1標準曲線製定……………........................…...............20
4.3.4.2.2松乳菇DNS還原醣測定…………………………………….....21
4.3.4.3松乳菇胞外多醣GPC分子量分析…………………………………21
4.3.4.3.1 GPC檢量線……………………………………………….....……21
4.3.4.3.2樣品製備……………………………….…….……………….…22
4.3.4.3.3 GPC分析條件……….……………………………….................22
第五章 結果與討論……………………………………..…………………………..24
5.1松乳菇液態醱酵生長曲線………………………………………………..…..24
5.2不同轉速及溫度對松乳菇胞外多醣生成之影響……………………………26
5.3乙醇濃度及添加時機對松乳菇胞外多醣生成之影響………………………29
5.4乙醇濃度及添加時機對松乳菇胞外多醣分子量影響………………………31
5.5 沙拉油劑量及添加時機對松乳菇液態醱酵胞外多醣生成之影響………...39
5.6沙拉油劑量及添加時機對松乳菇液態醱酵胞外多醣分子量之影響………41
5.7兩階段刺激培養對松乳菇液態醱酵產胞外多醣含量之影響………………49
5.8兩階段刺激培養對松乳菇液態醱酵產胞外多醣分子量之影響………...….51
第六章 結論…………………………………………………………………………53
第七章 未來展望..........................54
第八章 參考文獻………………………..…………………………………………..55

Chen H, Pellet LJ, Andersen HJ, Tappel AL.,1993,.Protection by vitamin E, selenium, and homogenate. Free Rad Biol Med,14:473-482.
Daniel C,Harris .2003. Sixth edition Quantitative Chemical Analysis
Dubois, M. ,K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers and F. Smith. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350-356.
DING x,Hou YL,Hou wR.Structure feature and antitumor activity Of a noveI polysaccharide isolated from Lactarius deliciosus Grav [J].CarbohVdr Polymers,2012,89(2)：397.402.
Fernando Sanchez ,Mario Honrubia , Pilar Torres. 2001.Effects of pH ,water stress and temperture on in vitor cultures of ectomycorrhizal fungi from Mediterranean forests [J] . Crytogamie , Mycol,22(4):243～258
Kinsella, J., Frankel, E., German, B. and Kanner, J.1993.Possible mechanism for the protective role of antioxidants in wine and plant foods. Food Technol. 47: 85-89.
KQIIMA T,TABATA K,ITOH w.et al.Molecular weight dependence of the antitumor activity Of schizophyllan[J]．Agfic Biol chem，1986，50(1)： 23】．232．
Liu, F., Ooi, V. E. C. and Chang, S. T. 1997. Free radical scavenging activity of mushroom polysaccharide extracts. Life Sci. 60: 763-771.
Mau J L, Lin H C, Song S F.2002.Antioxidant properties of several specialty mushrooms.Food Research International,35:519-526.
Okamura, M. 1994. distribution of ascorbic acid analogs and associated glycosides in mushrooms. J. Nutr. Sci. 40: 81-94.
Peters, H. U., Herbst, H., Hesselink, P. G. M., Lunsdort, H., Schumpe, A. and Deckwer, W. D. “The Influence of Agitation Rate on Xanthanproduction by Xanthomonas campestris..” ,Biotechnol. Bioeng., 34：1393-1397,1989.
Schechter, S.R. 1996. Fighting free radicals with antioxidant. Health Foods Business. 6: 28-29.
Xiang Ding, Yiling Hou, Wanru Hou. 2012. Structure feature and antitumor activity of a novel polysaccharide isolated fromLactarius deliciosus Gray．Carbohydrate Polymers 89397– 402
Miller, Gail Lorenz. "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 1959,31 (3): 426–428.
丁紅梅。2007。紅麴多糖抑瘤作用初步研究。菌物研究。5（3）：171~173。
王向華。2000。雲南乳菇屬貿易種的分類學研究。雲南植物研究。綜述與專題評論。22(4):419～427
王伯徹，陳啟楨，華傑。1998。食藥用菇類的培養與應用。食品工業發展研究所報告。187頁。新竹。台灣。
王雲，譚著明，何興元。2003。湖南的松菌。食用菌學報。10(2):24～28。
王會榮，張志雁，陳名君。2016。松乳菇菌絲體培養特性的研究。P10 - 11。
王輝憲，李會良，姚俊。1994。湘西松乳菇、紅汁乳菇中金屬元素的測定及其營養價值的研究。吉首大學學報 (自然科學)。15 (5) :63～66 。
吳三橋，周選國，李新生。 2001。松乳菇中氨基酸及其他營養素含量的測定。氨基酸和生物資源。23 (3) :5～6。
吳嘉興。2006。助益菌對樟芝液態發酵多醣產率之影響。國立東華大學生物技術研究所碩士學位論文。
呂欣怡。2003。舞菇多醣體成分之分析研究。南台科技大學。化學工研所。碩士論文。
李河，周國英，蘭貴紅。2007。松乳菇子實體多糖提取工藝及其組分的研究。中南林業科技大學。西南石油大學化學化工學院。03期。P58–61。
周慶珍，潘高潮，尤梅立等。2001。貴州野生松乳菇化學成分及產品開發研究。貴州科學。19(3):56～60。
林天送。2008。自由基化學與醫學。科學發展。432期，48-53。
林慧芬。2004。紅葡萄酒之抗氧化活性。輔仁大學食品營養學研究所碩士論文。
林親雄，陳京元。2002。碳源和氮源對松乳菇菌絲生長的影響。食用菌學報。 9(1):44～46。
柯麗霞。2003。黃山地區松乳菇的生態分佈和生態環境調查。安徽師範大學生命科學學院。食用菌學報。02期，P21-23。
柯麗霞。2002。松乳菇的抗菌活性研究。安徽師範大學，生命科學學院。01期，P63-64。
洪千雅。2000。以草抗氧化機能性之研究。國立中興大學食品科學研究所博士論文。
張天鈞。2007。自由基與老化。Medicine Today Vol.34, No.10。
敖常偉。2002。松乳菇菌絲深層發酵及其多糖功能評價。中南林學院。5.1。
敖常偉。2002。松乳菇的研究。
郭婕。2007。氧化壓力的因應之道。科學發展。411期。40-45。
陳少珍，韋仕岩，吳聖進等。2004。野生松乳菇菌絲的分離試驗。食用菌。(1)。 12～13。
陳楊瓊，丁祥，伍春蓮，范曾麗，羅利，侯怡鈴。2012。
松乳菇多糖抗腫和免疫調節活性研究。食用菌學報03期。P73–78。
童麗霞。1999。蜂膠抗氧化之研究。中山醫學院營養科學研究所碩士論文。
楊明毅，徐虹。2001。松乳菇的研究與開發。中國野生植物資源。20 (2) :29～30。
熊濤，肖滿。2005松乳菇研究進展。南昌大學生命科學學院。330047。
劉旭東。2002。中國野生大型真菌彩色圖鑒。北京:中國林業出版社。
劉伯康、陳惠英、嚴國欽。1999。數種傳統食用植物甲醇萃取物抗氧化性之研究。中國農業化學會誌。37（1）：105-116。
劉樹錚。2001。惡性腫瘤放射治療的新思考。中國實驗診斷學。 5（3）：143~144。
劉露，宋波，趙大群，許婷，丁祥，侯怡鈴。2016。松乳菇多糖(LDG-A)對S180荷瘤小鼠生理生化指標的影響。04期，P380-384。
潘崇環，孫萍，龔翔等。2004。珍稀食用菌栽培與名貴野生菌的開發利用。北京:中國農業出版社。300～309。
蔣雅慧。2004。添加物對樟芝菌絲體與抗氧化活性生成之影響。東海大學化學工程學研究所碩士論文。
冀寶瑩，陳超，鄧春海等。2001。野生松乳菇菌種分離的研究。微生物學雜誌。 21(2):56～60。
盧玉振，李祥，周磊。2016。靈芝多糖的抑瘤作用及對小鼠免疫系統影響的實驗研究。河北醫學。22（2）：190~192。
羅珮文。2001。台灣數種特有水果抗氧化活性及清除自由基能評估。輔仁大學食品營養學研究所碩士論文。
蘭貴紅。2003。松乳菇多糖的研究。
林親雄，陳京元。2002。碳源和氮源對松乳菇菌絲生長的影響食用菌學報P44 - 46。
錢葉，丁祥，曾益春，伏雷，朱洪慶，張楠，侯萬儒，侯怡鈴。2017。松乳菇多糖刺激免疫細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的研究。P220 - 226。
龍明有。2011。界面活性劑之添加對桑黃液態醱酵生產多醣體之影響及其多醣 體刺激胰島素分泌之特性研究。明新科技大學化學工程研究所。國科會計畫編號：NSC 98-2221-E-159-005
李倩茹。2002。松乳菇營養評價及發酵工藝研究。中南林學院碩士論文
龐甯、張佳琪、齊進、薑彬慧，微生物胞外多醣及生物合成途徑研究現狀(J).微生物前沿,2017,6(2)：27-34
松乳菇菌絲的培養研究 湖北中醫雜誌2016年12月第38卷第12期 李芳平1，彭晶玲1，王業靜1，楊豔芳1，2一，吳和珍 (1．湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢430065；2．中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，湖北武漢430061；3． 老年病中藥新產品湖北省協同創新中心，湖北武漢430065)
松乳菇菌絲深層培養營養因子及發酵條件研究 周國英 李倩茹 劉君昂 Apr.2003