臺灣博碩士論文加值系統

摘要
Antrodia camphorata俗名牛樟芝，是在台灣發現特有的真菌類品種，它的子實體已被當作中草藥使用在各種不同的疾病的治療中。 最近的在體內實驗(in vivo) 研究中已經顯示牛樟芝的粗萃取物能改善肝臟功能，增加免疫而且抑制癌的生長。 本研究的目地是由牛樟芝的菌絲體對人類的肝癌細胞上的藥物作用識定出生物活性化合物。 我們藉由使用人類的肝癌症細胞株進行高通量篩選分析及搜尋粗萃物的生物活性物質，而不是使用費時和昂貴的動物實驗。 起先，我們很高興發現，當牛樟芝的菌絲體和子實體的粗萃物處理於人類的肝癌細胞株Hep 3B 48 小時，獲得IC50分別為 44.25 和 12.22 μg/mL。 牛樟芝的菌絲體粗萃物進一步放入矽膠管柱中進行分離，將之分開成十二部份後再分別處理於人類的肝癌細胞株Hep 3B，我們發現顯著的生物活性在第六部份(F6)其IC50 為6.4614 μg/mL，之後我們使用HPLC 和 TLC來純化出F6活性的成分和使用 MS和NMR 及 IR 來進行化學結構識定。 此化合物被鑑定為1-hydroxy -3-isobutyl -4- [4-(3-methyl-but-2-enyloxy)-phenyl]-pyrrole-2,5-dione（分子式： C19H23NO4 ; 分子量： 329.16）。 此化合物分別處理於人類的肝癌細胞株Hep G2和Hep 3B 48小時其IC50 分別為9.903 μg/mL和 6.388μg/mL。

Abstract
Antrodia camphorata, “niu-chang-chih”, is a unique species of fungus found in Taiwan . Its fruit body has been used as Chinese herb in treatment of various diseases. Recent in vivo studies have revealed that crude extracts of Antrodia camphorata can improve liver function, increase immunity and inhibit the growth of carcinoma. The objective of this research is to identify bioactive compounds from Antrodia camphorata’s mycelia with pharmaceutical effect on human liver cancer cells. We used high throughput method to screen and search for bioactive substances from the crude extract by employing human liver cancer cell based assay, instead of slow and expensive animal testing. At first, we were pleased to find that, when treating Hep 3B (a human liver cancer cell) with crude extracts of mycelia and fruit body of Antrodia camphorata for 48 hr, the IC50 values of 44.25 and 12.22 μg/mL were obtained, respectively. The crude extract of Antrodia camphorata was further fractionated (two times) on a silica gel column. These separated fractions (twelve fractions in total) were individually treated with Hep 3B cells. We found that the fraction 6 (F6) has salient bioactivity with a significant IC50 value of 6.4614 μg/mL. The active ingredient in F6 was purified by both HPLC and TLC and structurally identified by FAB MS, NMR and IR. The compound identified was 1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-but-2-enyloxy)-phenyl]-pyrrole-2,5-dione (formula: C19H23NO4; molecular weight: 329.16). In the treatment of both Hep G2 and Hep 3B cells for 48 h, this compound gave the IC50 values of 9.903 and 6.388μg/mL, respectively.

章節目錄
第一章 文獻回顧………………………………………………… 001
第一節 『牛樟芝』的相關研究回顧…………………… 001
第二節 市售各類抗癌藥物簡介………………………… 027
第三節 肝癌簡介………………………………………… 048
第四節 『細胞凋亡』的相關研究回顧………………… 057
第二章 高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物… 088
第一節 細胞培養與抗肝癌先導藥物化合物篩選方法… 091
第二節 先導藥物化合物萃取、分離與純化方法……… 108
第三節 先導藥物化合物篩選實驗結果………………… 115
第四節 先導藥物化合物化學結構鑑定………………… 135
第三章 以p53、bax、bcl-2 之m-RNA層次進行先導藥物化合
物對人類肝癌細胞株HepG2凋亡途徑之探討………… 148
第一節 p53、bax、bcl-2 之m-RNA簡介與primer設計 150
第二節 人類肝癌細胞株HepG2 total RNA 之抽取…… 158
第三節 將Total RNA透過RT-PCR方式合成cDNA再利用
bcl-2、bax 、p53的引子和PCR放大………… 166
第四節 實驗結果………………………………………… 172
第四章 其他牛樟芝菌絲體產物分析…………………………… 178
第一節 牛樟芝菌絲體精油定性分析…………………… 178
第二節 牛樟芝菌絲體初步類抗氧化物質分析(SOD-like)182
第三節 牛樟芝粗三萜快速萃取與不同靈芝屬之指紋鑑
定與比較………………………………………… 188
參考文獻 ………………………………………………………… 198

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