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研究生:吳美莉
研究生(外文):WU,MEI-LI
論文名稱:嗜水性需氣單胞菌幾丁基因之選殖及在大腸桿菌之表現
指導教授:張敏政張敏政引用關係
指導教授(外文):ZHANG,MIN-ZHENG
學位類別:碩士
校院名稱:國立成功大學
系所名稱:生物化學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1990
畢業學年度:78
語文別:中文
中文關鍵詞:幾丁質嗜水性需氣單胞菌大腸桿菌南氏吸漬法異化敏感基因開放釋讀架
外文關鍵詞:(CHITIN)AEROMONAS-HYDROPHILA
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幾丁質(chitin),是以β(1-4) 鍵結N-乙醯葡萄糖胺(N-Acetylglucosamine) 而成之
無分支聚合物,一般存在於節肢動物之外殼及真菌類之細胞壁上。幾丁 (chitinase
) 是一種可分解幾丁質的酵素,我們期望能藉著幾丁 基因之選殖(cloning) 提供此
種酵素之有效來源,並且探討酵素機制及基因層次之特性。
Aeromonas hydrophila CH1是自土壤中篩選得到,可分泌幾丁 的革蘭氏陰性桿菌,
我們自其中篩選出幾丁 的基因,並進行蛋白質及基因層次之探討。本篇論文主要內
容包括三大部分:第一部分為以大腸桿菌MC1061為宿主,質体pBR322為載体,構築A
.hydrophila CH1 的機因庫。以膠狀幾丁質為受質,大腸桿菌JA221 為宿主,自基因
庫中篩選到具有幾丁 活性的基因。將選殖到的幾丁 基因進行次選殖,縮短插入基
因長度至 4.5Kb,並作限制圖譜解析。最後再以南氏吸漬法(Southern blotting) 來
証實選殖到的幾丁 確實源自於A.hydrophila CH1。第二部分為蛋白質層次之分析;
將A.hydrophila CH1及含幾丁 基因之大腸桿菌的細胞外粗萃取酵素,以親和性吸附
法(affinity adsorption) 進行幾丁 之純化,並以SDS-PAGF分析,顯示所選殖到之
幾丁 之活性,發現其活性相當,每毫克的蛋白質中皆含15∼20單位的幾丁 。在有
關幾丁 調節機制之研究,幾丁 表現可受到碳源之影響,由A.hydrophila CH1及含
幾丁 基因之大腸桿菌而來之幾丁 皆可被幾丁質誘發,且可被葡萄糖強烈抑制。第
三部分為利用Henikoff所發展的單向刪除法,將4.5Kb 的幾丁 基因分解成23個連續
且重疊之DNA 片段,再利用雙去氧鏈終結法得到完整的幾丁 基因的DNA 序列。
由上述實驗指出,幾丁 基因應屬於一種異化敏感基因(catabolite senstive genes
) 在其上游應有調節基因存在,並且其調節訊號可被大腸桿菌認知。由DNA 序列分析
,我們可在其5'- 近旁基因區域,找到 CRP鍵結處,-10 區域及-35 區域之保留序列
,並且得知其開放釋讀架(open reading frame)約為 1.9kb。

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