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Titin(又稱connectin)是肌原纖維中的巨大蛋白質分子(2400-3000KD),成直線形, 寬
約3-4nm,長約900nm,普遍存在於各種橫紋肌中, 單一分子由Z-line到M-line, 延伸半
個肌節, 兩分子對稱於M-line與thin filaments及thick filaments 平行, 一般認為
titin 將A-band中的myosin filaments固定於適當位置, 為肌passive tension 的主
要來源。以往對titin 分子的研究都趨向用免疫染色法觀察, 一般的生化方法很難直
接用來研究titin 的分子構造, 因其分子過於巨大, 且形態上無明顯的特征( 直線形
), 利用protease消化也不易穩定地得到特定的片段加以研究, 因此我們設計一些實
驗, 配合immunoblotting的方法對titin 分子的方向性及其功能區做初步的探討。
為了探討其方向性, 我們先將titin 以trypsin 消化, 找出含有兩個不同單株抗體ep
-itopes(A2,A12, 分別距M-line 0.75,0.69μm,即A2在Z-line方向,A12在M-line方向
) 的片段, 再以carboxypeptidase Y由C 端消化之, 發現A2 epitope先消失, 因此推
測titin 分子的C 端在Z-line的方向, 其相反方向(M-line)則為N 端所在。
本實驗室先前曾產生四株單株抗體(A2,A12,E2,F3), 另外由Dr.Marion.L.Greaser(Un
-iversity of Wisconsin U.S.A.)處獲得三株(D10,E9,H10), 利用此七株單株抗體,
以immunofluoresence-staining的方法測量其epitopes所在的位置, 并觀察不同肌節
長度下其epitopes位置的差異。有三株單株抗體(D10,E9,F3) 染色位置在I-band中,
且隨機節長度不同而有相當程度的變動。另四株(A2,A12,E2,H10) 的epitopes則位於
A-band中, 不隨肌節長度變動。可見titin 分子的I-band區較具伸展性(extensible)
,A-band 區則否。
本實驗室先前曾證明titin 與myosin(S1&LMM)及troponin有很強的結合, 其中myosin
是構成thick filaments 的蛋白質, 利用ATP 達成肌收縮,troponin 則規則地排列於
thin filaments上, 扮演調節的角色, 既然titin 分子與thick 及thin filaments平
行排列, 其上之myosin和troponin binding sites的分布便很有趣, 我們先以Solid-
phase binding assay 確定troponin三個subunits(Tn-T,Tn-I,Tn-C)中以Tn-T,Tn-I
與titin 有作用,Tn-C 則無。再用Tn-T做成Tn-T affinity column, 分離與Tn-T結合
的titin 片段, 以immunoblotting的方法定出片段所在位置, 發現在A-band中A12 ep
-itope附近處有troponin binding sites, 其他epitopes所在的位置則未發現有此情
形。以myosin affinity column重復類似的實驗得到的結果與Tn-T相同。本實驗的結
果并不排除titin 分子的其他部分亦有myosin或Tn-T binding sites的可能, 因為實
驗中所使用的titin 片段濃度太低( 濃度高易沉澱),可能影響結果, 但同時在距M-li
-ne 0.69μm 附近(A12 epitope, 在A-band中) 發現myosin及Tn-T binding sites,
是否意味著titin 與肌收縮的機制有某種關系, 這是一個值得繼續探討的問題。另外
我們利用ATPase microassay 證明titin 不直接對myosin的ATPase活性造成顯著影響
, 但經由對troponin結合間接影響肌收縮的可能則須進一步探討。
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