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本實驗旨在選殖人類腎上腺素接受器亞型的全長基因,期望以后能以基因轉殖方法在 真核細胞內表現,建立離體實驗模式,進而探討其調控機轉。 依藥理學的特性,α 腎上腺素接受器可區分為α A,α B及αC 三類亞型。按照基 因選殖研究,則顯示至少有三種亞型基因,分別被定位於人類的第二、第四和第十對 染色體。本實驗室先前已選殖到位於第二對染色體的亞型:α C2之部份基因(Clone A) 。現為了選殖此α 接受器亞型的全長基因以進行表現研究,故采用DNA 聚合繪 連鎖反應(Polymerase Chain Reaction) (PCR) 方法,按已發表之α C2 DNA序列設 計三組引子對,以人類Genomic DNA 為模板,成功的復制了與預期大小符合之DNA 片 段(∼1.4Kb) 。南方雜合實驗顯示其與Clone A 具有高度序列同質性。為了鑒定此PC R 產物確包含人類α C2全長基因,DNA 限制繪圖譜分析及全長DNA 序列分析乃為必 要。故將PCR 產物轉殖入載體pBluescript KS(+) 后再轉形至E.coli xL-l-Blue。以 菌落雜合方法篩選到七個含有1.4Kb 嵌入體之基因株。限制繪圖譜分析顯示其中C3∼ C6含有完整嵌入體。本實驗報告Clone C3之全長DNA 序列分析, 證實此Clone 包含人 類α C2之全長基因。轉譯區內有兩個胺基酸有替換現象。將此基因之胺基酸序列與 迄今已知所有腎上腺素接受器相比可以得知越膜區具高度序列同質性,而細胞內第三 轉折區則因種別,亞型別而具高特祑性。若與同類亞型基因( 即Isoceptor)相比則可 看出越膜區幾為完全相同且細胞內第三轉折區亦含高達67% 之Homology。檢測此Clo- ne之B''端序列證實其具有基因表現必備之澗基"G" 在(+4)位置可供作真核細胞核醣體 起始轉譯所需之結合位將致力於應用此Clone 作基因表現研究。
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