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以選殖的B 型肝炎病毒(HBV) DNA 轉染到肝癌細胞株, 發現在高度分化的肝癌細胞株 能分泌大量的B 型肝炎表面抗原(HBsAg) 及核心相關抗原,HBc/HBeAg 。此兩種抗原 在HuH-7 肝癌細胞株的表現量最高且持續25天之久。以型態,浮力密度鑒定分析及p- reS1表面抗原之存在,證實轉染后的HuH-7 細胞株會產生類B 型肝炎病毒顆粒。由於 這些類病毒顆粒含有聚合繪及蛋白激繪活懷且其病毒基因體限制繪圖譜(restriction map)與用以轉染的HBV DNA 相同, 顯示其與天然產生的病毒具相同之性質。以抗X 基 因產物抗血清亦可鑒定到17 kDa及22 kDa的蛋白質。所以,四個HBV 的開放編閱結構 (open reading frame)在此組織培養系統均可測到其產物且有病毒顆粒及大量之核心 顆粒分泌到細胞培養液。故此系統可提供新的模式來研究病毒之組合及其他相關問題 。 對於HBV 病毒顆粒的組合迄今仍所知有限。故本實驗利用此研究模式探討HBV 核心顆 粒之穩定性及其組成物相互間之作用。結果發現釋放到細胞外核心顆粒之HBcAg 以雙 硫鍵形成寡聚體(oligomers) ,而細胞內核心顆粒之HBcAg 則沒有雙硫鍵之形成。進 而以pH7.5, pH10, 3 M NaCl 及4 M 尿素處理核心顆粒, 發現含雙硫鍵的細胞外核心 顆粒比細胞內核心顆粒穩定。由這些結果顯示,雙硫鍵之形成對病毒核心顆粒構造的 完整性非常重要。 由於HBV 以內部起始之方式來轉譯其聚合繪, 此與反轉錄病毒產生核心- 聚合繪融合 蛋白之機轉不同。故HBV 聚合繪之包裹不像反轉錄病毒直接利用融合蛋白將聚合繪包 進核內。為了研究HBV 聚合繪之包裹,本論文首先探究核心顆粒內聚合繪與其他組成 物之間是否有交互作用。結果顯示P 基因產物以非共價鍵之方式與核心顆粒內之HBc- Ag直接緊密的形成復合體,此復合體即使在0.5% SDS存在下, 仍結合在一起。此外, 我們發現HBxAg 亦存在於核心顆粒內。進一步以遺傳法分析,證實P 基因產物與HBc- Ag的結合性具遺傳及免疫的專一性。這些結果推測HBV 聚合繪包裹之機轉可能為透過 聚合繪與HBcAg 之交互作用組合而成。 同時,本研究亦發現核心顆粒以未知的分泌途徑釋放到細胞培養液中,由pulse and chase 的分析結果顯示核心顆粒之分泌速率比HBsAg 慢,其分泌半生期(t )大於24 小時。因此,此系統提供一個新的模式來研究非傳統性蛋白質分泌途徑之機轉。
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