本實驗採用兩種方法來選殖 Xanthomonas compestris pv. campestris （ Xc ）
染色體的啟動子區域。一為兩選殖法，另一為構築泛寄主的啟動子選殖載體供直接
選殖。 啟動子選殖載 pKM005 以 HindIII 切割後， 用 mung bean nuclease 或
Klenow fragment 處理，切齊或補 HindIII 的 sticky end。 Xc 染色體以 PvuII
切割後與上述的 pM005 粘接，並轉形 E.coli JM103Y。 在 Maconkey plate 挑出
15 個紅色菌落， 分析其 B-gaiatosidase 活性。 隨後與寄主載體 pKMLT 行 in
vivo recombination 形成 cointegrate，然後以三親交配的方法送入 Xc 中。 其
轉形株在 X-gal 的培養上皆呈現藍色菌落。 分析七個在 E.coli 中能表現
B-galactosidase 活性之轉殖株的 DNA 序列。 以 mung bean nuclease 處理過的
四個 clones 均無 Xc 染色體片段的插入的 DNA 片段分為 227bp （ E8 ），34bp
（ E10 ）與 4bp （ E16 ）。 E8 有類似 E.coli 的 -10， -35 consensus
sequence 和 ribosome binding site， 也有譯起始 codon ATG 可以和 lacZ in
frame。由於 E10 的 insert 序列上無啟動子、ribosome binding site 亦無 ATG
轉譯起始碼，所以其能表現的原因不明。利用上述二段選殖法得到的 Xc 轉形株攜
帶的質體非常大，不分析。
本研的一工作為構築泛寄主啟動子選殖載。供直接篩選 promoter region 於 Xc。
以 pRK415 的衍生質體 pFJ2 為主體， 刪除與複製無關的 DNA 序列後， 得到一
5.5Kb 的泛寄主載體 pHC1。pHC1 加入多重選殖座後，接入 pKM005 之 lac ZY 基
因為報導基因。 為防止上游的啟動子 read through， 在 lac 基因上游接上一個
Thra terminator， 此質體命名為 pNT。 pNT 可以經由電孔法送入 E.coli 和 Xc
中，其轉形株皆能抗四環徽素。帶有 pNT 的 Xc 轉形株在 X-gal plate 上不會形
成藍色菌落但 E.coli 轉形株的菌落皆為藍色， 意味在 Xc 與 E.coli 的轉譯 /
轉錄系統或與 lac 基因表現有關的背景有很大的差異。
#9203440
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