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研究生:謝國珍
研究生(外文):XIE, GUO-ZHEN
論文名稱:柑橘潰瘍病病原菌線狀噬菌體cf1之溶菌斑混濁度基因及噬菌體DNA插入寄主染色體之研究
論文名稱(外文):Studies on the plaque turbidity gene and the integration of phage DNA into host chromosome of filamentous phage cf1 from xanthomonas campestris pv. citri
指導教授:郭宗德郭宗德引用關係
指導教授(外文):HE, KAI-GUANG
學位類別:博士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:植物學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1992
畢業學年度:80
語文別:英文
論文頁數:115
中文關鍵詞:柑橘
外文關鍵詞:CF1之溶菌DNA
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線狀噬菌體Cf1 的寄主為柑橘潰瘍病病原菌,所呈現的溶菌斑為混濁型(turbid),
但是在一般的培養過程中,會發現有澄清型(clear) 溶菌斑,其發生的機率為 10
﹣,因此將具有混濁型溶菌斑的Cf1 命名為Cf1t,而具有澄清型的溶菌斑則命名
為Cf1c,兩者在特性上有明顯的差異,差別如下:(1)被Cf1c感染過的寄主生長
情形會受到抑制,而被Cf1t感染過的寄主,則不會受到影響。(2)被Cf1c感染過
的寄主,所釋放出來噬菌體量比Cf1t高,兩者相差約20倍。(3)經由溶菌斑互補
實驗分析的結果顯示,混濁型溶菌斑的表現型為顯性,而澄清型溶菌斑的表現型為
隱性。基於上述觀察認為有一基因決定溶菌斑的混濁度,特稱此基因為溶菌斑混濁
度基因,簡稱pt基因。
利用Cf1t與Cf1c基因組DNA 交換片段的方法,定出NcoI/KpnI(591個鹼基對)和溶
菌斑混濁度的表現有直接相關性,選取四株噬菌體分析此段DNA 的序列,與Cf1t比
較的結果,發現其中三株(Cf1c-1,2,3)在閱讀框II (ORF II) 的上游區域發生鹼基
改變的突變,而其中一株(Cf1c-4)則在ORF II上游區域發生鹼基缺失。更進一步只
特異性的在Cf1t的ORF II之字碼子區域(codon region)之KpnI切割位置上作用,使
之缺失4個核酸之後再以Klenow作用,導致閱讀框構轉移突變,所形成的重組
噬菌體稱Cf1tdK,Cf1tdK呈現的溶菌斑即由原來的混濁型轉變為澄清型,因此認為
ORF II就是pt基因所在的位置,即在Cf1 限制圖譜的NcoI到PstI之間,基因長度
約為500 bp。
經由電腦程式分析pt基因的序列,結果顯示pt基因會製造出18.2 kD 的蛋白質,並
且在第34到第53個字碼(codon)位置的胺基酸序列,與DNA連結蛋白質(DNA binding
protein)所共通具有的胺基酸序列有明顯的相似性。將pt基因利用Glutathione-S-
Transferase fusion protein vector (pGEX-2T) 在大腸桿菌中表現,則會使得大
腸桿菌的生長受到抑制。至於pt基因的功能研究,則是根據被 Cf1t 、 Cf1c-1 及
Cf1tdK感染的寄主,所合成的噬菌體DNA 量之比較,以及利用構築好的具pt基因之
插入性載體pKSKP-4t將pt基因送入寄主中,觀察出pt基因的功能和被感染細菌產生
的噬菌體DNA 合成量有關,而且只要來自Cf1t的完整pt基因存在,就會抑制被感染
細菌合成噬菌體DNA 的量,並且導致釋放出來的噬菌體量減少。
將Cf1 的attp及不同的Cf1 DNA 片段,黏接在X. C. pv. citri 中不具複製功能的
pBluescript 質體上,並加上Kanamycin resistance gene ,當作篩選標幟,分析
結果顯示,如果只有attP並不能發揮插入的功能,必須還要Cf1 中的EcoRI/KpnI (
2.0 kb) DNA 片段存在時,才能將不具複製功能的質體插入X.C. pv. citri的染色
體中,而使得菌株能抗Kanamycin ,在Kanamycin 固態培養基上長成菌落在推算出
插入的效率達106 cells/μg DNA 。若在EcoRI/KpnI DNA中的限制切割位處 (
SnaBI、NcoI)加入amber stop linker ,就會使得插入的功能喪失,因此推測此段
DNA 應會製造出蛋白質參與反應。
另外,利用此不具複製功能的質體來分析Cf1c插入的功能,結果顯示雖然Cf1c發生
鹼基改變的位置落在EcoRI/KpnI DNA區域中,但是並不影響Cf1c插入的功能;同時
因 pt 基因在 KpnI 切割位之後具有功能決定性的區域,並不包含在具插入功能的
EcoRI/KpnI中,因此認為Cf1 插入的功能和混濁度基因並不相關,最後並利用Cf1
EcoRI/KpnI DNA構築成具限制單一切割位(single cut)的插入性載體。
目錄
中文摘要
英文摘要
壹 緒言
貳 材料與方法
參 結果
第一章 溶菌斑混濁度基因的研究
一 cfl所呈現的溶菌斑外型及混濁度基因的定義
二 定出cfl基因組中影響溶茵斑混濁度DNA片段的位置
三 SphI/PstI DNA片段序列之差異
四 定出和溶菌斑混濁度有關的框讀區
五 利用閱讀框構區轉移突變來證明ORFII即是溶茵斑混濁度基因
六 溶菌斑混濁度基因功能的探討
七 以插入性載體選殖出具有功能的溶菌斑混濁度基因
八 利用選殖出來的pt基因來改變溶菌斑的混濁度
九 溶菌斑混濁度基因在大腸桿菌中的表現
第二章 cfl噬菌體DNA插入寄主染色體的功能的研究
一 利用非複製性質體來研究插入功能
二 以pKSK-1質體選殖出具有插入功能的cf1 DNA片段
三 以pKSKP-1質體選殖出具有插入功能的Cf1 DNA片段
四 分析EcoRI/KpnI DNA片段中間部份是否參與插入功能
五 EcoRI/KpnI DNA片段序列的框讀區分析
六 插入性載體pKSKP-4的構築
七 利用插入性載體分析cflc-1及cflt DNA插入的功能
肆 討論
伍 參考文獻
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