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研究生:魏大同
研究生(外文):Wey Ta Tung
論文名稱:木腐黴纖維素外雙醣水解脢I在分子生物學上之探討
論文名稱(外文):Molecular biological studies of cellobiohydrolase I gene from Trichoderma koningii G-39
指導教授:許宗雄許宗雄引用關係
指導教授(外文):Hseu Tzong Hsiung
學位類別:博士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:生命科學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1993
畢業學年度:81
語文別:中文
論文頁數:120
中文關鍵詞:木腐黴纖維素外雙醣水解脢I蛋白純化分子選殖異體表現基因座座落
外文關鍵詞:Trichoderma koningiicellobiohydrolase Imolecular cloning
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  本論文之目的在探討木腐黴纖維素外雙醣水解脢I酵素之功能與性質
,及其基因之選殖、定序、異體表現與基因座定位。當木腐黴受到纖維素
等因子誘導後,會製造大量纖維素水解脢,其中纖維素外雙醣水解脢I佔
胞外蛋白質總量的百分之六十以上。經由蛋白純化及電泳分析顯示,此酵
素之分子量約為 68,000,等電位值約為4.0。採用對硝基苯-β-纖維雙醣
甘為反應基質測得此酵素之比活性為每毫克1.4國際單位。相對於其他纖
維素水解脢,纖維素外雙醣水解脢I對於結晶形纖維素有較佳之作用能力
。這是因為它對纖維素具有高度結合能力。比較此酵素的纖維素外雙醣水
解能力及纖維素結合能力發現,兩者之物理與化學性質不盡相同,由此研
判,這兩種作用能力應分屬於酵素之不同部份。  經由分子選殖法得到
之纖維素外雙醣水解脢I基因(包括其互補DNA及基因座DNA)進行核酸定
序分析及比對發現,此基因可轉譯一含513胺基酸之蛋白質,其中並含有
兩段插入子。此一來自koningii菌株的基因和早先已知來自reesei菌株者
之間只有六個核酸次序不同:一個在5''端未轉譯位置,二個在轉譯部位造
成無意義突變,另三個在第一插入子中。在此基因之上游,發現有五個部
位其序列與其他真菌發現的碳代謝抑制子結合部位相同。在此數個部位之
下游與轉譯起始點之間,亦有數個類似真核生物轉錄因子結合部位之序列
存在。  利用脈衝場凝膠電泳技術,我們進一步探討纖維素外雙醣水解
脢I基因及內木聚糖脢Ⅱ基因之染色體座落。首先經由電泳分析,將木腐
黴基因座分出五條帶,其大小分別為4.4、4.7、 5.7、6.7及7.2百萬鹼基
對。其中最小者具有極明亮之螢光強度,顯示可能有兩條以上同樣大小的
染色體在此位置,由此得到木腐黴基因座大小至少有28.7百萬鹼基對。經
南方氏墨漬法分析得知纖維素外雙醣水解脢I基因及內木聚糖脢Ⅱ基因均
和 4.4百萬鹼基對大小之染色體帶雜合,但此帶可能含兩條以上之染色體
,故有待進一步研究以確定此二基因是否在同一染色體上。
Cellobiohydrolase I (CBH I) from a filamentous fungus
Trichoderma koningii G-39 has been purified by SP- Sephadex
C-50 and DEAE-Sephadex A-50 ion-exchange chromatographies. It
showed a molecular weight of 68 k and pI of 4.0 upon sodium
dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
and isoelectric focusing. This enzyme has a specific activity
of 1.4 unit/mg using p-nitrophenyl-b-D-cellobioside as a
substrate and prefers to interact toward crystalline
substrates. It exhibited both exocellobiohydrolytic and
cellulose binding activities, with different chemical and
physical characteristics. CBH I encoding gene cbh1 has been
cloned, including a 1.4 kb cDNA and 7.0 kb genomic DNA. The
sequence analysis reveals that part of the cloned sequence
encodes a 513 amino acids-protein. The coding region is split
by two introns with lengths of 67 and 63 base pairs.
Nucleotide sequence alignment to the putative promoter region
of cbh1 reveals significant homology to the carbon catabolite
repressor binding sites of Aspergillus nidulans CREA and
Saccharomyces cerevisiae MIG1 promoters which respond to a wide-
domain regulatory system of glucose repression. In addition,
several transcription factor binding site-like sequences are
identified in 5'' flanking region of cbh1 as well. The
electrokaryotype of T. koningii is obtained by pulsed field gel
electrophoresis (PFGE). The fungal chromosomes were separated
to five bands. The lowest band showed non-proportional
fluorescent intensity, it is possible that at least two similar
size chromosomes comigrated on this band. Accordingly, the
fungal genome is thought to be constituted of five or more
chromosomes. The sizes of chromosomes are estimated as 4.4,
4.7, 5.7, 6.7 and 7.2 Mb, respectively, and the genome size is
calculated to be about 28.7 Mb. The results of PFGE followed
by Southern hybridization indicates that cbh1 and xyl2, a gene
coding for an endoxylanase, are both mapped at the lowest band.
TABLE OF CONTENTS
LIST OF FIGURES
LIST OF TABLES
ABBREVIATIONS
中ABSTRACT
英ABSTRACT
CHAPTER 1 GENERAL INTRODUCTION
CHAPTER 2 PROTHIN PURIFICATION AND ENZYME CHARACTERIZATION
CHAPTER 3 MOLECULAR CLONING
CHAPTER 4 HETHROLOGOUS GENE EXPRESSION
CHAPTER 5 CHROMOSOMAL LOCATION
CONCLUSION
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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