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研究生:謝永祥
研究生(外文):Hsieh, Yung Hsiang
論文名稱:應用花粉管法及基因槍法於蝴蝶蘭基因轉殖之研究
論文名稱(外文):Studies on transformation of Phalaenopsis by pollen tube pathway and microprojectile delivery system.
指導教授:黃鵬林
指導教授(外文):Huang, Pung-Ling
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:園藝學系
學門:農業科學學門
學類:園藝學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1993
畢業學年度:81
語文別:中文
論文頁數:77
中文關鍵詞:蝴蝶蘭基因轉殖
外文關鍵詞:Phalaenopsistransformation
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本研究之主要目的是利用報導基因 (reporter gene)進行蝴蝶蘭之基因轉
殖,嘗試建立具有較高效率以及穩定性高之轉殖系統,以便能應用在蝴蝶
蘭的育種工作上。根據蝴蝶蘭之特性以及一些預備試驗評估,認為花粉管
法(pollen tube pathway)和基因槍法 (particle gun) 兩種方式較適用
於蝴蝶蘭之基因轉殖。因此, 本試驗即針對此兩種基因轉殖方式進行試
驗研究。整個研究主題,主要分為三部份: (1).花粉管生長及受精之觀察
。 (2).花粉管法之基因轉殖。(3).基因槍法之基因轉殖。在花粉管生長
與受精方面, 觀察結果顯示,蝴蝶蘭之子房和大孢子母細胞,於授粉後
才開始發育。 花粉粒在授粉後三天已發芽長出花粉管。大約在授粉後50
天, 其大孢子母細胞開始進行減數分裂,胚囊之形成應在授粉後60天左
右,而受精約在授粉後70天發生,在授粉後100天,其未成熟胚已大致成
型。在花粉管法基因轉殖方面,以含有GUS和NPTⅡ基因之 pRT99gus質体
進行處理。幼胚及幼苗以組織化學法分析GUS活性,已獲得部份的轉殖証
據,但由於蝴蝶蘭具有類似GUS酵素的活性,使得分析工作倍感困難。經
進一步,抽取花粉管法處理的群体幼苗DNA,進行聚合連鎖反應以及南
方氏點漬分析,証明了花粉管法確實可達到基因轉殖之目的。在基因槍法
方面,以 PDS1000/He型基因槍650psi壓力,處理蝴蝶蘭之幼胚,於三天
後進行GUS活性分析,可得到約30﹪的暫時表現轉殖比率。經處理後30天
,以南方氏點漬分析,顯示少部份的外來DNA可以整合進入染色体內。
The purpose of this study was to establish an efficient and
stable gene transfer system for Phalaenopsis. Two methods of
transformation were tested: pollen tube pathway and particle
bombardment. To establish the transformation system via pollen
tube pathway, the development of ovary and megaspore mother
cell in Phalaenopsis is microscopically examined. Pollens
germinated readily 3 days after pollination. Megaspore mother
cells undergo meiotic division at about 50 days after
pollination. Ten days later, megaspore gives rise to the one-
nucleatea embryo sac. The zygote was observed at 70 days after
pollination. Fertilization presumably occurs at this time. The
pRT99gus plasmid containing GUS and NPTⅡ genes was injected
into Phalaenopsis ovary at different times after pollination.
Transformed Seedlings evidenced by polymerase chain reaction
using primers specific for GUS gene were found when the time
for DNA injection was between 25 and 40 days after pollination.
An intrinsic GUS-like enzyme activity was found when the
seedlings were 30-day-old. Stable integration was demonstrated
by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from pooled
seedlings. An alternative transformation protocol using
germinated seedlings as target tissues was developed by using
PDS1000/He particle gun with a gas pressure of 650 psi. The
ratio in a population of seedlings expressing GUS activity when
assayed 3 days after bombardment was as high as 30﹪. Southern
blot analysis of genomic DNA isolated from seedlings 30 days
after bombardment showed positive signals. This study
demonstrated that transgenic Phalaenopsis plants could be
produced using particle bombardment.
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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