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研究生:吳政道
研究生(外文):Jeng-Dau Wu
論文名稱:可調控表現之Ha-ras致癌基因於老鼠肝細胞中之研究
論文名稱(外文):Inducible Expression of Ha-ras Oncogene in Immortalized Mouse Hepatocyte
指導教授:賴明德賴明德引用關係
指導教授(外文):Ming-Der Lai
學位類別:碩士
校院名稱:國立成功大學
系所名稱:生物化學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1994
畢業學年度:82
語文別:中文
論文頁數:70
中文關鍵詞:致癌基因 Ha-ras可調控式表現老鼠肝細胞腫瘤
外文關鍵詞:Oncogene Ha-rasInducible expressionMouseHepatocyteTumorIPTG
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為了研究在肝癌的發生過程中,Ha-ras致癌基因扮演著何種角色,我們計
劃建立可利用大腸桿菌之乳糖控制子序列(lacO)來控制Ha-ras致癌基因(
T24)於 BALB/c小鼠肝細胞中表現,且其可專一性地受到誘導子IPTG存在
與否所控制的調控系統。之後便可用於送入BALB/c小鼠體內觀察其腫瘤形
成之表現。首先釐清三株BALB/c小鼠肝細胞(ML-1、ML-2及ML-3)中內生性
Ha-ras基因之特性。吾人利用南方轉漬雜交法來分析三株小鼠肝細胞之內
生性 Ha-ras基因。在以0.66 kb及4.7 kb兩段探針進行雜交試驗之後,三
株小鼠肝細胞之內生性 Ha-ras基因並沒有發現擴增(amplification)或是
重排 (rearrangement)的現象存在。其次,利用直接PCR產物進行DNA序列
分析亦顯示出三株小鼠肝細胞之Ha-ras基因在胺基酸序列12、13及61處
之 DNA 序列屬正常。我們利用Hygromycin B作為轉染(transfection)細
胞所需之選擇性抗生素。將約8,000,000個ML-1細胞以協同轉染(co-
transfection)之方式將 27.mu.g的 pSVlacOras 質體及3.mu.g的 p3'SS
質體送入,1:20展開培養 (subculture)。大約三至四星期可見到細胞群
落的產生。藉由南方轉漬雜交法之分析,可發現吾人之選殖細胞株中存在
有多個pSVlacOras質體的嵌入,且有重排之現象發生。若將選殖細胞株
4-2,5-3 及 6-1 以 2.5 mM IPTG 處理 24 至 36 小時之後,利用北方
及西方轉漬法可觀察到 Ha-ras RNA及蛋白產量有劇烈的增加。軟膠試驗
顯示出經 2.5 mM IPTG 持續處理選殖細胞株3-6,4-2,5-3及6-1可增加
它們的細胞群落形成能力;而於小鼠腫瘤試驗中,若以2.5 mM IPTG 處
理24小時後注射入小鼠體內,亦可見到較高的腫瘤形成率 (3-6: 86%;
4-2: 58%; 5-3: 100%; 6-1: 100%)。這些選殖細胞株可用來作為研究
Ha-ras 致癌基因在肝臟細胞轉化過程中所扮演角色之模式系統,進而可
研究活化的Ha-ras致癌基因對於細胞內基因調節之影響。

To study the effects of Ha-ras oncogene on tumorigenesis in
hepatoma, we established a mouse live (ML) cell line containing
inducible mutant human Ha-ras gene (T24), which can be
specifically induced by a lactose analogue, IPTG. We then
delivered it to BALB/c mice to observe tumorgenic potency. Two
parts of experiment were performed to evaluate the status of
Ha- ras in three mouse liver cell lines (ML-1, ML-2, ML-3).
Firstly, we characterized the c-Ha-ras gene of three ML cell
lines by Southern blot analysis. No amplification or
rearrangement of c-Ha-ras gene of three ML cell lines were
observed. Secondly, to determine whether c-Ha-ras contain point
mutations on codon 12, 13 and 61, we amplified a 663 bp genomic
DNA fragment containing c-Ha-ras gene with PCR. Direct DNA
sequencing on this PCR product revealed no mutation on Ha-ras
gene in three ML cell lines. Approximately 8,000,000 ML-1 cells
were co-transfected with 27.mu.g pSVlacOras and 3.mu.g p3'SS
plasmid DNA. Integration of multiple copies of pSVlacOras into
chromosomes and rearrangement were observed in our
transfectants by Southern blot analysis. After the treatment of
2.5 mM IPTG for 24-36 hours, the dramatically inducible
expression of Ha-ras mRNA and protein were observed by Northern
and Western blot analysis of the trnasfectants 4-2, 5-3 and
6-1. The result of soft agar assay revealed the increases of
tumorigenicity of transfectant 3-6, 4-2, 5-3 and 6-1 by 2.5 mM
IPTG induction, and higher tumor incidence was observed in BALB/
c mice assay (3-6: 86%; 4-2: 58%; 5-3: 100%; 6-1: 100%). These
cell lines provide a convenient model for future studies on the
transformation of hepatocyte by Ha-ras oncogene, and the
effects of activated ras expression on the regulation of
cellular genes.

QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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