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研究生:林佑錦
研究生(外文):Lin You-Ching
論文名稱:利用農桿菌轉殖人類嗜中性白血球胜■-1基因於菸草之研究
論文名稱(外文):Agrobacterium - mediated transformation of gene encoding human neutrophil peptide (HNP)-1 in tobacco (Nicotiana tabacum)
指導教授:藍清隆
指導教授(外文):Lan Ching-Long
學位類別:碩士
校院名稱:輔仁大學
系所名稱:生物學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1995
畢業學年度:83
語文別:中文
論文頁數:75
中文關鍵詞:防禦素人類嗜中性白血球胜■-1抗微生物胜■菸草
外文關鍵詞:DefensinHuman neutrophil peptide(HNP)-1antimicrobial peptideTobacco
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防禦素(defensins)為哺乳動物細胞中一類具抗微生物及細胞毒性的胜■
家族。人類嗜中性白血球胜■( human neutrophil peptide, HNP )-1 ,
-2, 和 -3等三種防禦素在人類嗜中性白血球之嗜蔚藍顆粒(azurophil
granules)內佔總蛋白質之30-50%。本計畫以農桿菌媒介轉殖方法將
HNP-1 cDNA 轉殖入菸草Wisconsin 38中,希望能使轉殖菸草具有抗微生
物的特性。購自 American Type Culture Collection 的含 HNP-1
cDNA 之質體 pUC-4A 經 DNA 定序後發現缺失■鹼基。利用 Oligo 程式
所產生的4條引子,經重組 PCR(polymerase chain reaction) 以產生正
確的 HNP-1 cDNA片段。以 HNP-1 cDNA 片段取代質體 pBI121 中之 β-
glucuronidase 基因,而成為 HNP-1cDNA 表現載體 pBD-H1。以直接轉形
方法將表現載體 pBD-H1 轉形入農桿菌 C58C1/pGV2260中。把菸草葉盤和
轉形成功之農桿菌 C58C1/pGV2260/pBD-H1 共培養約5分鐘,葉盤接著移
至 MS104KaCf 篩選培養基 ( 即含 250 μg/ml kanamycin , 250μg/
mlcefotaxime , 100 μg/ml ascorbic acid , 1.0μg/ml
6-benzylaminopurine , 0.1 μg/ml naphthaleneacetate 的
Murashige & Skoog 培養基 ) 中再生及篩選。約兩星期後,將癒合組織
上的芽體移至新鮮的 MS104KaCf 篩選培養基繼續篩選。再約兩星期後,
將存活的芽體移至 MS0KaCf 根誘發培養基 ( 即含 100 μg/ml
kanamycin, 250 μg/ml cefotaxime 的 MS 培養基 ) 中培養。約三星期
後有根系生長的植株,經馴化過程移至土壤生長並進行分子生物學上檢測
。7株擬基因轉殖菸草植株以 PCR 檢測是否 HNP-1 cDNA 存在於其基因
組中,結果有6株為正反應。其中5株更以墨點轉漬法確定 HNP-1 cDNA
整合入基因組中以 RT-PCR ( reverse transcription-polymerase
chain reaction ) 確定 HNP-1 mRNA 的表現。此5株的總蛋白質粗抽液
對 Escherichia coli, Erwinia carotovora, Pseudomonas
solanacearum, Pseudomonas syrinagae pv. tabaci , Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria 以抑制環法分析,結果無抗微生物活性,
但其中3株總蛋白質在 15% SDS-PAGE 上 3.0 KDa 附近有明顯的譜帶,
疑是 3.4 KDa 之成熟型 HNP-1 ,但仍需日後研究確定。

Three defensins , human neutrophil peptide(HNP)-1,-2 and -3,
comprise 30-50 % of total proteins in azurophil granules of
human neutrophils. This project is intended to introduce gene
encoding HNP-1 into tobacco Wisconsin 38 via Agrobacterium-
mediated transformation protocol to develop the transgenic
tobacco with antimicrobial property. The HNP-1 expression
vector , pBD-H1 , were introduced into Agrobacterium
tumefaciens strain C58C1/pGV2260 by direct transformation.
Tobacco leaf discs were cocultured with the engineered bacteria
( C58C1/pGV2260/pBD-H1 ) and subsequently cultured on the MS104
KaCf selection medium for 2 weeks. The survived shoots were
then cultured on the MS0KaCf rooting medium for root induction.
Finally, plants with well- grown root system were hardened and
subsequently moved to green- house. Of the seven putative
transgenic plants examined, the HNP-1 cDNA sequence within the
genomes of six plants were proved by PCR method. The
integration of HNP-1 cDNA into the transgenic tobacco genome
and its successful transcription of HNP-1 mRNA were futher
confirmed by the dot bolt assay and the RT-PCR method in these
5 plants. However, the crude protein extracts from these 5
plants showed no antimicrobial activity in the inhibition
zone assay against Escherichia coli, Erwinia carotovora,
Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syrinagae pv. tabaci,
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. An apparent band near
3.0 KDa on the 15% SDS-polyacrylamide gel was tempted to
suggest to be HNP-1 and needed to be futher confirmed.

QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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