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研究生:紀怡蘭
研究生(外文):Yi-Lan Jih
論文名稱:PseudomonasputidaD-Hydantoinase基因在Escherichiacoli和Pseudomonasputida之高度表現
論文名稱(外文):Overexpression of Pseudomonas putida D-Hydantoinase Gene in Escherichia coli and Pseudomonas putida
指導教授:曾義雄曾義雄引用關係許文輝許文輝引用關係
指導教授(外文):Yi-Hsiung TsengWen-Hwei Hsu
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:植物學系
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1995
畢業學年度:83
語文別:中文
論文頁數:84
中文關鍵詞:基因表現遺傳工程大腸桿菌
外文關鍵詞:OverexpressionPseudomonas sp.Escherichia coli
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工業上被應用於生產 b-lactam 抗生素的前驅物 D-p-
hydroxyphenylglycine (D-p-HPG),本實驗利用聚合?@連鎖反應 (
polymerase chain reaction )選殖 Pseudomonas putida 的 D-
hydantoinase 基因 (dht 基因 ),隨後利用各種不同的表現載體
(expression vector)及宿主 (host cell) 進行 dht 基因的表現,探討載
體的起動子 (promoter) 、宿主及培養條件對菌體產生 DHT 的影響,以尋
求 DHT 的最適生產條件及提高 DHT 的產量。構築在 pET-21b,
pBluescript II KS+, pSP72, pSP73 及 pMMB66EH 等表現載體上之 dht
基因,均會表現。其中以構築在 pET-21b 上之質體 pET36, 其 dht 基因
於 Escherichia coli 中表現最佳。而 dht 基因於 E. coli中的表現優
於在 P. putida 中。 SDS-PAGE 分析中亦發現菌體所產生的 DHT 可達總
蛋白質的 30 % 左右。在 E. coli 培養條件方面,以 basal medium 培
養,能使菌體濃度提高,其中又以甘油為碳源較適合。以乳糖來誘導起動子
,發現用 5 mM 的濃度即可誘導基因的表現,其效果比 IPTG 更佳。接
種 2 % 菌體至 basal medium ,培養 3 至 5 小時後,再添加乳糖,誘
導起動子啟動,於誘導後 5 小時收集菌體,可以得到較高之酵素活性,
約達 170 U/l,為原始菌株的十七倍。在 P. putida 培養條件方面,同樣
以 basal medium 培養,能使菌體濃度提高,以乳糖來誘導起動子,其效果
與 IPTG 相當,且同時再加入 0.2 % hydantoin 誘導,可以提高 DHT 的活
性。在接種 5 % 菌體至 basal medium, 培養 6 小時後,添加 1mM IPTG
及 0.2 % hydantoin,誘導起動子啟動,並於誘導後 2 小時收集菌體,可得
到較高之酵素活性(約 124 U/l ),為原始菌株的十二倍。
Pseudomonas putida D-hydantoinase gene ( dht ) was cloned into
arious expression vectors to investigate the optimal condition
for the production of D-hydantoinase ( DHT ) by Escherichia
coli and Pseudomonas putida. The dht gene was prepared by
polymerase chain reaction and cloned into expression vectors
pET-21b, pBluescript II KS+, pSP72, pSP73 and pMMB66EH,
respectively. This gene could be expressed in E.coli and P.
putida under the control of T7 or tac promoter. The highest DHT
activity was obtained by using pET21b expression vector and
expressing the dht gene in E. coli. The SDS-PAGE analysis
revealed that about 30 % of cellular protein were DHT.
Optimization of the growth and induction conditions was
performed in order to increase the enzyme production. The
recombinant E. coli was found to produce maximal cell mass in
the Basal medium containing glycerol as carbon source. The dht
gene was expressed at high level in E. coli in the presence of
5 mM lactose as an inducer. After 3 to 5 h incubation in Basal
medium and 5 h induction by lactose, the DHT activity reached
170 U/l which was about 17-fold higher than that of gene donor
strain.The recombiant P. putida was also found to produce
maximal cell mass in the Basal medium. The dht gene was
expressed at high level in P. putida in the presence both 1mM
IPTG and 0.2 % hydantoin as inducers. After 6 h incubation in
Basal medium and 2 h induction by IPTG and hydantoin, the DHT
activity reached 124 U/l.
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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