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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:王斐
研究生(外文):Wang, Fei
論文名稱:牛傳染性鼻氣管炎病毒去氧尿核甘三磷酸鹽水解酵素之表現,純化與功能分析
論文名稱(外文):Expression, purification, and functional analysis of the infectious bovine rhinotracheitis virus dUTPase
指導教授:鍾楊聰鍾楊聰引用關係
指導教授(外文):Chung Yang-Tsung
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:獸醫微生物學研究所
學門:獸醫學門
學類:獸醫學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1996
畢業學年度:84
語文別:中文
論文頁數:50
中文關鍵詞:牛傳染性鼻氣管炎病毒去氧尿核甘三磷酸鹽水解酵素
外文關鍵詞:infectious bovine rhinotracheitis virusdUTPase
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酵素 dUTPase 普遍存在於自然界,在細胞核甘酸代謝過程中扮
演著重要的角色。為探討此酵素結構與功能之關係,參考國外已發表的研
究報告,我首先選殖了牛傳染性鼻氣管炎病毒 (台灣雲林株) dUTPase 基
因,並將此基因的完整轉譯序列 (coding sequence;包括 325 個氨基
酸) 轉接於表現載體 pET-28b,在大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS 細胞中大量
表現。使用 SDS-PAGE 分析經 IPTG 激化過的細胞萃取蛋白,在 38 kDa
處出現一明顯的環帶,和預期的重組蛋白產物分子量大小相符;而未受激
化的對照組則闕如。並且此環帶的強度伴隨著 IPTG 加入時間的長度而增
強。此大量表現的重組蛋白質,在其前端帶有來自表現載體的 6 個組氨
酸標記 (histidine tag) ,可被固定於親和性樹脂 (His.Bind resin)
之二價鎳離子捕捉,而達到快速純化的目的。以上述方法純化得的重組
dUTPase 經酵素活性測試顯示其具有高度活性。已發表之其他物種 (包括
大腸桿菌、皰疹病毒、反轉錄病毒等) 的 dUTPase 在其氨基酸序列中皆
具有五個保留性區段 (conserved motifs),與此酵素的功能應有重要關
連,是以我們針對保留性區段之所在位置選用了適當的限制酵素,進行
dUTPase 缺損基因的構築。經蛋白質表現與純化之後,由酵素活性測試結
果得知,所構築的缺損蛋白中,蛋白質 N 端 21 個氨基酸缺損者仍具有
大部分酵素活性,而另外三種去除保留性區段之缺損蛋白 (氨基酸
106-150、193-235、270-325 之缺損) 的活性則完全喪失。本實驗之結果
對未來關於牛傳染性鼻氣管炎病毒 dUTPase 分子特性之深入研究,提供
了一個值得參考的指標。

Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase
(dUTPase) is widespread in nature and plays important roles in
nucleotide metabolism and DNA replication. For protein
engineering studies on the structure-function relationship of
the enzyme, I have cloned and identified the gene encoding the
dUTPase of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV) strain
YL previously isolated in Taiwan and expressed the protein in
Escherichia coli system. The coding region of this gene was
positioned downstream of the T7 lac promoter on the expression
vector pET-28b. Transformation of this recombinant plasmid into
E. coli BL21(DE3)pLysS cells allowed expression of the protein
by IPTG induction. SDS-PAGE analysis of cellular proteins from
IPTG-induced cells revealed a prominently stained band
corresponding to a molecular mass of 38 kDa, which is in good
agreement with the prediction from the DNA sequence. It was also
observed that the intensity of the 38 kDa band increased with
time of incubation with IPTG. The pET-28b expression vector
codes for six histidine residues that can be expressed at the N-
terminal end of the target dUTPase. The histidine tag binds to
divalent cations (Ni2+) immobilized on the His.Bind resin, so
the recombinant dUTPase can be rapidly purified by affinity
chromatography. By using the pET expression system and affinity
chromatography together, I have obtained sufficient dUTPase with
activity for its functional analysis. Five conserved motifs has
been found by comparing the amino acid sequences of E.coli,
retrovirus, and herpesvirus dUTPase. In order to know the
possible importance of the conserved motifs, I chose proper
restriction enzymes to construct the dUTPase deletion mutants by
truncating the conserved motif of the dUTPase gene.The dUTPase
assay analysis of four deletion mutants revealed that except the
N-terminal 21 amino acids deletion mutant those including motif
2, motif 3, or motif 5 deletion all lost its dUTPase activity.
These results build up the foundation for detailed studies on
dUTPase molecular characteristics.

QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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