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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:簡相堂
研究生(外文):Jane, Shiang-Tang
論文名稱:利用基因重組技術構築Brevibacteriumdivaricatum離胺酸生產菌株之研究
論文名稱(外文):Studies on the Construction of Lysine-Producing Strains in Brevibacterium divaricatum by Recombinant DNA Technology
指導教授:蘇遠志蘇遠志引用關係
指導教授(外文):Su, Yuan-Chi
學位類別:博士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:農業化學系
學門:農業科學學門
學類:農業化學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1996
畢業學年度:84
語文別:中文
論文頁數:223
中文關鍵詞:棒狀桿菌離胺酸醱酵菌種改良基因擴增基因破壞與置換
外文關鍵詞:corynebacterialysine fermentationgene amplificationgene
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本研究中嚐試結合傳統與現代之育種技術, 構築穩定而高產之 Brevi-
bacterium divaricatum ATCC 14020 離胺酸生產菌株.利用DNA 聚合酵素
鏈鎖反應 ,可以由棒狀桿菌之染色體中合成 ask , hom, thrB 和 hom-
thrB 基因之 DNA 片斷, 並選殖在質體 pSUMN18 中 . ask 基因已被定
序. 上述基因之特性可用於區別B. divaricatum 與其它棒狀桿菌.本研究
中構築具有嵌入子之嵌入質體 , 並以標誌交換變異與嵌入變異策略將
hom, thrB 與 hom-thrB 基因分別加以破壞 . 其中以pUC4-KISS 之 kan
基因做為選擇標誌 . 利用此兩種策略可獲得數十株具有營養要求性之嵌
入轉形株 .其中由破壞 hom 基因之嵌入子所獲者具有高絲胺酸要求性
.由破壞 thrB 基因之嵌入子所得者,皆為要求蘇胺酸 , 而由破壞hom-
thrB之嵌入子所得者, 悉為需求蘇胺酸與高絲胺酸 . 由南方氏轉漬分析
證實其基因構造 , 推測其中有以一次互換之同源重組機制使嵌入子嵌入
宿主之染色體中 . 亦有以雙重互換之機制使嵌入子與染色體中之同源序
列置換 .上述嵌入轉形株皆可於培養液中蓄積1-3% 之離胺酸 . 其中破
壞 hom和 hom-thrB 基因者 ,其產量較破壞 thrB 基因者為高 . 以雙重
互換機制置換之嵌入轉形株,其遺傳穩定性極佳, 離胺酸生產之複現性亦
佳 . 然以一次互換嵌入者, 其遺傳穩定性差, 且經過重複移殖後, 其產
量逐見退化.擴增含有回饋抑制已解除之 ask 基因的質體 pSUAK-45, 可
使其宿主具有 AEC 耐性 , 以及較高之 aspartokinase 活性和離胺酸產
量 . 含有 pSUAK-45 之 B. divaricatum ATCC 14020 , 其離胺酸之生產
受生物素之明顯抑制 . 經由培養基最適化, 其產量可達 12g/L . 含有
pSUAK-45 之嵌入轉形株 , 其於高濃度蘇胺酸下之離胺酸產量 , 較未含
pSUAK-45 者提高 3 - 5 倍 .嵌入轉形株之饋料批式醱酵時, 利用電腦監
控培養液之溶氧狀態, 並控制蘇胺酸與甲硫胺酸混合液之添加, 可使菌體
之生長與離胺酸之生產維持在最佳之狀態 . 在醱酵 68 小時之後 , 其離
胺酸蓄積量可達 66.6g/L, 對總糖之收率達 31%(g/g) .
The genes of ask, hom, thrB and hom-thrB amplified from Bre-
vibacterium divaricatum strains by PCR, were cloned in
pSUMN18, and manipulated for the construction of lysine
producers. "Integron"-bearing integrative plasmids were
constructed, and both of the marker-exchange and
integrational mutagenesis were applied for the disruption
of hom, thrB and hom-thrB genes. Several auxotrophic
integrants were obtained from both methods. The integrants
site-specifically inactivated at hom gene were homoserine-
requiring. Those blocked at thrB gene required thre- onine,
and those disrupted at hom and hom-thrB genes were threo- nine
and homoserine auxotrophic. Bothe single and double cross-
over homologous recombination mechanisms were proposed to
expla- in the integration and replacement. The auxotrophic
integrants accumulated1-3% lysine-HCl in the culture broth.
Those disrupted at hom and hom-thrB produced more lysine than
those disrupted at thrB. The integrants derived from double
crossover were extremely stable. Nevertheless, those der- ived
from single crossover were less stable, and the lysine pro-
uction was thus degenerated after repeated transfer.
Amplification of pSUAK-45 containing feedback released ask
gene conferred AEC resistance as well as higher
aspartokinase activity and lysine productivity in its hosts.
When optimized, 12g/L lysine-HCl could be produced in B.
divaricatum ATCC 14020. In fed-batch fermentation of the
integrants, a feeding strate- gy based on the excellent genetic
stability and the quick respon- se of threonine depletion to
the disolved oxygen was conducted. The growth rate and
lysine productivity of the cells were main- tained for a long
time. After 68-hour-cultivation, the lysine-HCl in the culture
broth was 66.6g/L, and the conversion yield to the total sugar
was 31% (g/g).
封面
中文摘要
英文摘要
誌謝
目錄
回序
表序
壹、緒論
一.離胺酸之市場概況
二.離胺酸增產之研發領域
三.棒狀桿菌之分類與特性
四.離胺酸之生合成路徑與調控
五.離胺酸生合成之代謝網路分析與理論收率
六.傳統方法選育離胺酸高產菌株之策略
七.基因重組技術在離胺酸生產菌株改良上之應用
八.研究動機與實驗策略
貳、實驗材料與方法
一.使用菌株與質體
二.培養基與培養條件
三.DNA操作技術
四.PCR技術
五.南方氏DNA轉漬技術
六.轉形
七.菌株遺傳穩定性分析
八.AEC耐性菌株之篩選
九.酵素之抽取與檢測
十.分析方法
十一.離按酸生產試驗
參、結果
一.AEC耐性株之篩選
二.ask基因選殖
三.ask基因β-subunit之DNA序列分析
四.hom、thrB及hom-thrB基因之選殖
五.B.divaricatum電轉形之最適化
六.hom、thrB及hom-thrB基因之破壞與嵌入質體之構築
七.嵌入轉形株之篩選
八.嵌入轉形株之基因構造分析
九.嵌入轉形株之性狀檢測
十.嵌入轉形株之遺傳穩定性
十一.嵌入轉形株之離胺酸生產試驗
十二.擴增ask基因對離胺酸生產之影響
十三.去除嵌入轉形株中之kan基因
十四.小型醱酵槽之離胺酸生產試驗
肆、討論
一.利用ask及hom-fhrB基因之特性區別B.divaricatum與其他棒狀桿菌
二.B.divaricatum之宿主鑒試修飾系統
三.基因嵌入與置換技術在工業微生物育種上之應用
四.AEC耐性,Aspartokinase與ask基因
五.以溶氧狀態控制蘇胺酸與甲?酸混合液之鐀料添加策略之探討
六.離胺酸超產菌選育之展望
伍、結論
參考文獻
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