臺灣博碩士論文加值系統

抗B型肝炎病毒及抗腫瘤藥物之研發，一直是人們非常關切的問題。近年來，隨著分
子生物學、免疫學、病毒學、腫瘤學、細胞學的飛速發展以及測試方法的科技化，對
此二方面均能深入到分子生物層次，予以闡明。本論主針對此二方向，探討中草藥之
抗B型肝炎及抗腫瘤的作用，結果顯示：（一）抗B型肝炎病毒部份----B型肝炎病毒
引起人類急性或慢性肝炎且與肝癌之發生有密切關連。至今尚無法有效治療肝炎及肝
癌，因此開發新的抗B型肝炎病毒藥物具重要性。人類肝癌細胞株（MS-G2），可持續
產生B型肝炎病毒體至培養基中，為很好的體外篩檢抗B型肝炎病毒中草藥之模式。
甲氧基歐芹酚（osthole）分離自中藥獨活（產生Angelica pubescens Maxim ），可
明顯示抑制（70％）體外培養之（MS-G2）細胞的B型肝炎病毒表面抗原之產生，但對
於產生，但對於產生B型肝炎病毒核/e抗原之抑制並不明顯（10％）。用氯化銫等比
重離心分析，發現B型肝炎病毒之22nm及42nm Dane氏顆粒體的泌出顯著降低。且經由
B型肝炎病毒內在DNA 聚合霉活性測定，亦顯示甲氧基歐芹酚可抑制具感染力之病毒
顆粒體之產生。然而用南方及北方雜化分析法，顯示B型肝炎病毒的基因組和核醣核
酸的轉錄在對照組和給藥組無顯著差別。因此抑制病毒表面抗原蛋白產生之機制可能
在蛋白質轉譯或轉譯後之調控。為探討其作用機制，進一步利用抗B型肝炎病毒表面
抗原之抗體，進行放射免疫澱法，顯示甲氧基歐芹酚會增加病毒表面抗原之醣化作用
，此作用可被Tunicamycin所阻斷。此為一個新的抗病毒機制，經由增加病毒表面抗
原的醣化作用，使病毒的外套結構體改變，從而抑制病毒。甲氧基歐芹酚可能成為有
效B型肝炎病毒藥物將予以探討。（二）抗腫瘤部份----臺灣醉魂藤植物（
Heterostemma bro-wnii Hay.）屬於蘿摩科，為臺灣特有品種，民間用來治療腫瘤及
肝疾。經由bio-assay directed fractionation所分離得的新成分醉魂藤素A（
heteromine A）在體外測試結果具抑制癌細胞生長之作用，可延遲它的細胞數目增殖
二倍所需時間。在人類肝癌細胞體外群落形成實驗，可顯著抑制細胞群落形成率。再
經由[3H]-胸腺嘧啶、[3H]-尿嘧啶併入測試，顯示醉魂藤素A抑制癌細胞的去氧核醣
核酸及核醣核酸的生合成。以3-（4,5-dimethylthiazol-zyl）-2,5-diphenyl
terazolium bromide（簡稱 MTT）測試法作指標，針對肺癌、肝癌、大腸癌、黑色素
癌、腺細胞癌、血癌、淋巴癌等七種人類常見的癌細胞共二十一種細胞株，結果顯示
醉魂藤素A 對血癌細胞的細胞有很強的毒殺作用，其次為，淋巴癌、食道癌及部分肝
癌細胞株。接著進行活體內抗腫瘤實驗，以嚴重免疫缺陷鼠皮下接種人類血癌細胞株
K562，腹腔投予醉魂藤素A 劑量200 ug，每星期兩次，給藥二至五星期具顯著抑制作
用（P<0.05）。進一步探討其抑制癌細胞之作用機制，以流動細胞計數器（
flowcytometer）檢測，發現肝癌細胞HuH-7的細胞週期（cell cycle），被停在Go/
G1期，但是在血癌細胞K562，醉魂藤素A，除了增加在Go/G1期的細胞，還促使K562的
細胞Apoptosis。血癌細胞株K562，給藥處理三天，收取其細胞萃取液，經西方點墨
法分析，顥示cyclin D及cyclin E的蛋白表現量受抑制，以histone H1作受質，實驗
結果發現醉魂藤素A可顯著抑制cyclin D及cyclin E所結合之激霉活性，且更進一步
証實其cyclin D之RNA量亦顯著減少。因此推論，醉魂藤素A對cyclin D及cyclin E蛋
白的抑制，導致細胞無法進入細胞週期的S期，而停留在Go/G1期，或進行Apoptosis
進而調控癌細胞的生長，達到抗腫瘤之作用。本論文，係以分子生物技術為工具，探
討來自中草藥的活性成分，其抗B型肝炎病毒及抗腫瘤之作用機制，期能提供一有用
之研究模式，並提供臨床之參考。

封面
目錄
中文摘要
英文摘要
壹、 緒論
第一部分 : 抗B型肝炎病毒
一、B型肝炎病毒之構造及其感染性
二、B型肝炎病毒之轉錄 (transcriptopn ) 及訊息RNA (mRNA )
三、B型肝炎病毒之轉譯 (translation )及期抗原(antigen )
四、B型肝炎病毒之複合製 (replication )
五、B型肝炎病毒組合 (assembly )與釋出 (secretion )
六、B型肝炎病毒之生活史 (life cycle )
七、抗病毒藥物之研發
第二部分 : 抗腫瘤
一、研究背景與腫瘤之成因
二、抗腫瘤藥物之研發
貳、材料與方法
一、細胞培養
二、抗病毒藥物之處理
三、Aspartate Aminotransferasen (AST)之測定
四、B型肝炎病毒表面抗原及核心/e抗原 之酵素免疫測定
五、大量抽取質體DNA (Large-scale isolation of plasmid DNA )
六、DNA轉染實驗 (DNA transgection )
七、細胞高分子量DNA的 抽取 (Isolation of high molecular weight DNA )
八、南方雜化法 (Southem hybridization )分析
九、北方雜化法 (Northem hybridisation )分析
十、放射免疫沈殿分析 (Radioimmunoprecipitation Assay, 簡稱RIP )
十一、西方點墨法(Westem blot )分析
十二、病毒顆粒的部分純化
十三、氯化銫密度階梯蘺心術
十四、HBV DNA 內在聚合 活性測定
十五、抗生素 tunicamycin 之抑制反應
十六、3H-thymidinen 或 3H-Uriding incorporation 分析
十七、細胞於甲基纖維素生長能力之測定
十八、在嚴重免疫缺陷鼠及裸鼠腫瘤形成能力 (Tumorigenicity in Sever Combined Immune Deficiency mice and Nude mice )
十九、Histone H1 激 活性分析
二十、流式細胞儀分析 (Flowcytometeric andlysis )
二十一、統計分析 ( Statistical andlysis )
參、結果
第壹部分:抗B型矸炎病毒之探討
一、六十種中藥抗B型肝炎病毒之篩選
二、Osthole 抗B型肝炎病毒作用之探討
三、Osthole其結構與活性之相關性(Strunture Activity Relationship; SAR)的探討
第貳部分:醉魂藤抗腫瘤之探討
一、醉魂藤素抑制肝癌細胞之生長
二、醉魂藤素抑制肝癌細胞之去氧核醣核酸及核醣核酸的生合成
三、醉魂藤素抑制肝癌細胞之體外群落形成率
四、最魂藤素使HuH-7在G0/G1 Phase的細胞增加
五、醉魂藤素對腫瘤之毒殺作用
六、醉魂藤素的活體內抗腫瘤作用之研究
七、醉魂藤素A三種劑量的活體內抗腫瘤作用之研究
八、醉魂藤素對K562細胞週期之調節
九、醉魂藤素A對K562細胞週期調節酵素之影響
十、北方雜化法 , 分析醉魂藤素A對HuH-7、HA22T及K562細胞內cyclin C 和cuclin D核醣核酸 (RNA )之影響
肆.討論
第壹部分:抗B型肝炎病毒
一、Ostgole 的抑制HBV作用在HBsAg蛋白轉譯或轉譯後之修飾 (translation or post-translational modification )
二、Osthole抑制表面抗原之量並且增強HBsAg的醣化作用(glycosylation )
三、動態分析(kinetic analysis ) . 再次證實Oathole增進HBsAg的醣作用
四、Osthole與Tunicamycin 作用之相互關係
五、Osthole其結構與活性之相關性(Struture Activity Relationship; SAR )的探討
第貳部分、醉魂藤素抗腫瘤之探討
一、醉魂藤素A對腫瘤之毒殺作用具專一性。
二、醉魂藤素A 在HuH-7會造成細胞生長停頓(growth arrest ) , 在K562則造成細胞Apoptosis(program cell death )。
三、醉魂藤素A抑制cyclin D及cyclin E的蛋白量及其所結合之激 活性 , 具有週期特異性。
四、醉魂藤素A作為抗癌新藥之評估。
伍.參考文獻
陸.表
柒.圖
捌.附錄
一、與本論文相關之研究報告