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研究生:李超煌
研究生(外文):LEE, CHAU-HWANG
論文名稱:差動共焦顯微術及其應用
論文名稱(外文):Differential Confocal Microscopy and Its Applications
指導教授:汪治平汪治平引用關係
指導教授(外文):JYHPYNG WANG
學位類別:博士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:電機工程學系
學門:工程學門
學類:電資工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1997
畢業學年度:85
語文別:中文
論文頁數:161
中文關鍵詞:差動共焦顯微術毫微米縱向解析率表面量測技術視頻顯像細胞黏彈性肌動蛋白微絲
外文關鍵詞:differential confocal microscopynanometer depth resolutionsurface profilometryvideo-rate imagingcell viscoelasticityactin filament
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本論文介紹一項稱為「差動共焦顯微術」的新式光學顯微術。這項技
術是以類似差動放大器的概念,利用共焦顯微術的縱向反應曲線在其線性
區中,訊號大小對樣本高度變化極為敏感的特性,來測量物體表面毫微米
的高度差異。 差動共焦顯微術具有
縱向解析率高、測量動態範圍大、工作距離長等特點。它的縱向解析率並
沒有一定的上限,主要是受限於系統的雜訊。以本論文中完成的原型系統
而言,縱向解析率高達2毫微米,比傳統共焦顯微術提高了100倍以上。由
於差動共焦顯微術並非利用干涉效應進行測量,其開迴路測量動態範圍可
遠大於波長,視光源波長與物鏡的數值孔徑而定;以波長0.63微米,數值
孔徑0.40的操作條件為例,開迴路動態範圍有3.6微米。差動共焦顯微術
是使用光波在遠場進行偵測,它的工作距離與一般光學顯微物鏡相同,有
數百微米,操作時不需以閉迴路鎖定樣本的高度。動態範圍大與工作距離
長這兩個特性使差動共焦顯微術可以執行高速掃描顯像。
在本論文中也說明了如何架設視頻顯像的差動共焦顯微鏡。採用共振式光
掃描器作快速線掃描,配合電流計式掃描器作圖框掃描,視頻顯像系統可
以在45毫秒內掃描出一張256 x 256圖素的影像,而且具有20毫微以上的
縱向解析率。這部視頻顯像系統可以輸出符合NTSC規格的畫面,方便影像
的紀錄與重播。對活纖維母細胞各種偽足活動的即時觀測,展現了視頻顯
像差動共焦顯微鏡獨特的應用潛力。 差動共焦顯微術的非侵入
性偵測能力,使它極為適合生物學上的研究。本論文中以光壓造成細胞的
微小形變,配合差動共焦顯微術來測量活細胞的黏彈特性。由於光壓造成
的形變量甚小,細胞的變形量都保持在線性可回復區間內,可以用簡單的
阻尼彈性運動方程式來描述細胞膜的運動。差動共焦顯微術的高解析率能
夠辨別由gel-to-sol transition所造成細胞質黏彈特性的微小變化。
除了量測形變量以外,差動共焦顯微術也能夠結合螢光顯微術,在細胞變
形的同時觀察胞內的生化反應。本論文中以胞內鈣離子濃度的變化為對象
,試圖定量地找出細胞骨架形變與細胞傳遞壓力訊號過程的關係。實驗結
果支持細胞是經由細胞骨架形變來傳遞壓力訊號的模型,更進一步指出主
要的壓力訊號路徑應該是肌動蛋白微絲結構的形變。這部份的實驗展現了
差動共焦顯微術在生物學研究上的應用潛力。
This thesis introduces a novel nanometer-resolution
technique, "differential confocal microscopy." Using
the sharp slopes of the axial response curve of confocal
microscopy, differential confocal microscopy can distinguish
nanometer height difference on sample surfaces. This technique
is named based on its analogy with differential amplifiers.
The main features of differential confocal microscopy include
high depth resolution, large dynamic range, and long
working distance. The depth resolution of differential
confocal microscopy is only limited by noise. In the prototype
system, a depth resolution as high as two nanometers has been
achieved. This is a 100-fold improvement compared with
conventional confocal microscopy. Because differential confocal
microscopy does not employ interferometric effects to
obtain high resolution, its open-loop dynamic range can be
much larger than a wavelength. For example, if the wavelength
is 0.63 micrometers, using an objective with 0.4 numerical
aperture, the dynamic range is as large as 3.6 micrometers.
By probing the sample with far-field optical wave, the
working distance of differential confocal microscopy is
hundreds of micrometers. Large dynamic range and long working
distance enable differential confocal microscopy to perform
high-speed imaging.
A video-rate differential confocal microscope has been
accomplished. By using a resonant scanner for the kilohertz
line-scan and a galvanometer scanner for the frame-scan,
the video-rate system can acquire a 256 X
256-pixel image in 45 milliseconds. The depth resolution is
better than 20 nanometers. This video-rate differential
confocal microscope outputs NTSC images, which are compatible
with ordinary video systems. The observation of rapid
motions of lamellipodia and filopodia of fibroblasts
demonstrates the unique ability of this video-rate differential
confocal microscope.
Differential confocal microscopy is very suitable for biological
researches because of its non-invasive nature. In this thesis,
this novel technique is utilized to study the elastic
response of living human fibroblasts. The cells are
minutely deformed by femtonewton optical force. During the
experiments, the deformation is kept in the linear reversible
region. Hence the movement of the cell membrane can be described
by the equation of motion of a damped harmonic oscillator.
The uncertainties of the measured damping constant and spring
constant are so small that the change of cytoplasmic
viscoelasticity caused by the gel-to-sol transition can be
detected. The combination of differential confocal
microscopy and fluorescence microscopy can reveal the
biochemical responses to mechanical strain in living cells.
In this thesis the calcium-ion response to mechanical strain is
observed. The experimental data support the model in which the
stress- signal transduction is related to the deformation of
cytoskeleton. It is verified that the actin-filament structure
is the main pathway to transduce the stress signal.
封面
目錄
第一章 前言
第二章 共焦顯微術的原理
2.1 共焦顯微術原理
2.2 共焦成像的理論模型 [6]
2.3 共焦顯微鏡系統
第三章 差動共焦顯微術
3.1 利用共焦顯微術測量表面微小高度變化
3.2 干涉共焦顯微術-毫微米的縱向解析率
3.3 快速顯像、毫微米解析率的新技術-差動共焦顯微術
3.4 差動共焦顯微術的解析率
3.5 反射率與角度可能所造成的測量誤差與校正
3.6 差動共焦顯微術與其他顯微技術的比較
第四章 差動共焦顯微鏡的架設與操作
第一部分:原型系統
4.1 系統架設
4.2 縱向解析率與動態範圍
4.3 三度空間影像
4.4 小於繞射極限樣本的影像
4.5 邊緣增強效應
4.6 回饋式差動共焦顯微鏡 [9]
第五章 差動共焦顯微鏡的架設與操作
第二部分:視頻顯像系統
5.1 視頻顯像規格與方法
5.2 視頻顯像差動共焦顯微鏡的光學架構
5.3 視頻影像的形成
5.4 視頻差動共焦顯微鏡的影像
第六章 應用:以差動共焦顯微術研究活細彈性反應
6.1 活細胞彈性研究的重要性與困難度
6.2 研究細胞彈性的實驗架設與方法
6.3 實驗結果:細胞彈性常數與阻尼常數的測量
6.4 結合差動共焦顯微術螢光顯微術觀測胞內鈣離子濃度與形變的關係
第七章 結論
附錄一 專利
附錄二 差動共焦顯微鏡原型系統之驅動程式
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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