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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:劉怡文
研究生(外文):Liu Yi-Wen
論文名稱:上皮生長因子對花生四烯酸十二位脂氧化酵素基因表現之調控
論文名稱(外文):Regulation of Arachidonate 12-Lipoxygenase Gene Expression by Epidermal Growth Factor
指導教授:張文昌張文昌引用關係
指導教授(外文):Chang Wen-Chang
學位類別:博士
校院名稱:國立成功大學
系所名稱:基礎醫學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:醫學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1997
畢業學年度:86
語文別:中文
論文頁數:162
中文關鍵詞:上皮生長因子基因表現調控十二位脂氧化酵素轉錄因子Sp1乾癬啟動者
外文關鍵詞:epidermal growth factor12-lipoxygenasegene expression regulationtranscription factorSp1psoriasispromoter
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自古到今,有關真核細胞的基因調節表現真象,一直是生物學界面對的謎題之一。到底這
些調節性的轉錄因子如何來增加基因的mRNA產生量?雖然至今答案仍不是十全十美,但卻
是一個相當吸引人的問題。動物細胞中的12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-
HETE)是由十二位脂氧化酵素代謝花生四烯酸而來的。上皮生長因子可以增加人類子宮頸
上皮癌A431細胞中的十二位脂氧化酵素活性,而其增加倍數約為原來的2倍,且在其活性
增加前2到4個小時,此酵素mRNA就已有增加的情形。所以本論文的研究主題即是探討上皮
生長因子誘導十二位脂氧化酵素的原因,尋求其基因啟動者上的上皮生長因子作用點。十
二位脂氧化酵素基因啟動者上的DNA序列,是一種富含GC,且缺乏TATA盒及CCAAT的序列特
性。將這個啟動者的5''端段切及3''端段切和螢光報告基因接合在一起,構成一系列的報告
基因建構體,再將各種不同的建構體送入A431細胞做短暫性表現。在這些報告基因建構體
中,我們發現自轉譯起始點前-224 bp到-100 bp的區域,是十二位脂氧化酵素啟動者活性
表現所必需須的,而且也是上皮生長因子的作用點。而為了分析這段區域,更利用點突變
技術來建構點突變報告基因;因為-224 bp到-100 bp上有3個可能的Sp1結合位置,所以點
突變重點首先就放在這三點上。當將這3個Sp1結合位置同時突變後的報告基因質體(SPM7)
送入細胞表現時,不但其基本表現降低,且上皮生長因子也完全失去對它的誘導作用。而
凝膠電泳中的DNA位移現象測試,得知這些富含GC的Sp1結合位置可結合Sp1及Sp3兩種轉錄
因子。若是將-158 / -150 bp及-123 / -114 bp這2個Sp1結合位置序列破壞,則十二位脂
氧化酵素啟動者活性會明顯減低,同時DNA位移測試的滯留現象也會消失,表示這2個Sp1
結合位置對此基因表現是絕對需要的。相同地,這2個Sp1結合位置也是上皮生長因子的作
用點,而且Sp1導致的DNA滯留現象有因上皮生長因子處理而被增強的情形。利用西方點墨
法來分析Sp1蛋白質,發現它並不會因為上皮生長因子處理而增加表現,但卻觀察到其在
電泳上的位置會略往下位移些。綜合以上結果,我們得知十二位脂氧化酵素基因啟動者上
的這2個Sp1結合位置,不但是其基本表現所須的,也是上皮生長因子誘導作用所必要的,
而Sp1和Sp3這2個轉錄因子則可能參與在這個調節作用中。牛皮癬是一種普遍的發炎性皮
膚病,其發病率在中國大陸約占0.4%人口比例。而牛皮癬病人的角質細胞,已證實有十二
位脂氧化酵素蛋白質及其代謝產物增加的情形;另一方面,病人的患部皮膚也會表現大量
的TGFa及其受體(上皮生長因子受體)。若是和本論文的研究結果聯想起來,發現病人的十
二位脂氧化酵素過量表現的原因﹐可能是在於其上皮生長因子受體路徑被活化之故。因此
,本研究成果可以提供牛皮癬病發機轉的一個新的思考方向。
The main question facing the eukaryotic gene expression field is the same toda
y as it has been for many years. How do regulatory transcription factors incre
ase the amount of mRNA produced by their target gene promoters? The answers ar
e still unclear and attractive. 12(S)-Hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-HETE
) is formed from arachidonic acid by 12-lipoxygenase (12-LOX). Epidermal growt
h factor (EGF) increases 12-LOX mRNA by about 2-fold with a lag period of 4 to
8 hr, which precedes the increase in 12-LOX activity by 2 to 4 hr in human ep
idermoid carcinoma A431 cells. In this project, we want to identify the 12-LO
X gene promoter which responds to EGF induction. The promoter of 12-LOX gene w
as found to be GC-rich, and it lacked TATA and CCAAT sequences. A series of 12
-LOX gene 5''- and 3''-deletion sequence were fused to upstream of the luciferas
e reporter gene and transiently transfected into A431 cells. Among these const
ructs, we identified a region spanning from -224 bp to -100 bp of initiation c
odon to be essential for both basal and EGF-induced expression of reporter gen
e. To identify the promoter region from -224 bp to -100 bp, we constructed poi
nt mutation constructs. There are three Sp1 binding boxes located in this prom
oter region, therefore, the first step of point mutation focus on these sites.
The basal luciferase activity and EGF induction was dramatically decrease in
the SPM7 construct which was mutated at three GC-rich regions. Gel shift assay
with antibodies of transcription factors showed that both Sp1 and Sp3 require
d highly GC-rich Sp1 sites within this region for binding. Disruption of two S
p1 recognition motifs residing at -158/-150 bp and -123/-114 bp markedly reduc
ed the basal 12-lipoxygenase promoter activity and abolished the retarded band
s in gel shift assay, indicating that these two Sp1 sites were essential for t
he gene expression. The same two Sp1 sites were also responsible for EGF-induc
ed expression of 12-LOX, and the Sp1-retarded band was increase after EGF trea
tment. In Western blotting analysis, Sp1 protein of EGF-treated cells was not
increase but shifted down compared with control cells. Taken together, the res
ults of these study indicate that two specific Sp1 consensus sites were involv
ed in the mediation of the basal promoter activity as well as EGF induction of
the 12-lipoxygenase gene, and Sp1 and Sp3 transcription factors might play a
role in their regulation.Psoriasis is a common inflammatory skin disorder, aff
ecting 0.4% of the population in China. The protein and metabolic product of 1
2-lipoxygenase are elevated in psoriasis keratinocytes. Both transforming grow
th factor a (TGFa) and its receptor the EGF receptor also are overexpressed in
psoriasis. According our research finding, the activation of 12-lipoxygenase
may due to the activation of EGF receptor signal pathway. Therefore, these res
ults offer an new direction for the inflammatory mechanism of psoriasis.
封面
目錄
中文摘要
英文摘要
縮寫指引
第一章 緒論
1-1 前提
1-2 何謂脂氧化酵素(lipoxygenase)
1-3 12-HETE之生物活性
1-4 十二位脂氧化酵素:分類,基因結構及活性表現調節
1-5 十二氧化酵素在態生理之角色
1-6 本論文研方向
第二章 尋求A431細胞的十二位脂氧化酵素mRNA之轉錄合成起始點(transcription initiation site)
2-1 目的
2-2 實驗材料與方法
2-3 結果
2-4 討論
第三章 十二位脂氧化酵素啟動者和報告基因(reporter gene)之建構工程(construction)
3-1 目的
3-2 實驗材料與溶液配製
3-3 實驗方法與結果
3-3-1 5''端段切之報告基因建構方法
3-3-2 3''端段切之報告基因建構方法
3-3-3 Spl-sites點突變之報告基因建構方法
3-3-4 SV40-LUC及SV40-pXLO-7-1的建構方法
第四章 利用報告基因觀察十二位脂氧化酵素啟動者對基因表現的調節
4-1 目的
4-2 實驗材料與方法
4-3 結果與討論
4-3-1 5''及3''端段切建構之報告基因的表現程度
4-3-2 其他5''端段切建構之報告基因的表現
4-3-3 Spl-sites點突變之報告基因表現結果
第五章 上皮生長因子對十二位脂氧化酵素啟動者之調控
5-1 目的
5-2 實驗材料與方法
5-3 結果與討論
5-3-1 5''及3''端段切建構之報告基因的表現程度
5-3-2 其他5''端段切建構之報告基因的表現
5-3-3 Spl-sites點突變之報告基因表現結果
5-3-4 SV40-pXP,SV40-LUC及SV40-pXLO-7-1之報告基因表現情形
第六章 利用凝膠電泳中的DNA位移象測試(electrophoretic mobility shift assay)觀察核蛋白質和ERE的結合狀況
6-1 目的
6-2 實驗材料與方法
6-3 結果與討論
6-3-1 12-LXpromoter-224bp到-83bp的核蛋白結合狀況
6-3-2 12-LXpromoter-224bp到-124bp的核蛋白結合狀況
6-3-3 12-LXpromoter-145bp到-83bp的核蛋白結合狀況
6-3-3 Spl-sites點突變後核蛋白結合情況的變化
6-3-5 EGF處理後的核蛋白質結合情況之改變
6-3-6 外送之Spl及Sp3.對十二脂氧化酵素起動者的誘導作用
第七章 利用西方點墨法(Western blotting)觀察Spl及Sp3蛋白質的變化
7-1 目的
7-2 實驗材料與方法
7-3 結果與討論
7-3-1 EGF處理A431細胞4,9,14及16小時的Spl變化情形
7-3-2 EGF處理A431細胞4,9,14及16小時的Sp3變化情形
第八章 結論
第九章 相關文獻之討論
9-1 EGF誘導之基因表現
9-2 經由Spl來達成外在因素誘導之基因表現
9-3 乾癬和上皮生長因子誘發十二位脂氧化脂酵素表現之關係
參考文獻
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