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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:王先閎
研究生(外文):Wang, Hsien Hung
論文名稱:胺基生太酵素催化水解螢光性酯類基質之動力學研究
論文名稱(外文):Kinetic Study of Aminopeptidase-Catalyzed Hydrolysis of Fluorescent Ester Substrates
指導教授:林萬寅林萬寅引用關係---
指導教授(外文):Hsien-Hung Wang
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:化學系研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1998
畢業學年度:86
語文別:中文
論文頁數:106
中文關鍵詞:酵素酯類水解動力學
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中文摘要Aminopeptidase-I(AP-I) 為市售Pronase E 所分離純化的一種外生太酵素,分
子量為29820 Da。利用停止流(Stopped-Flow),直接激發法的技術在330nm激發帶有Dns的
螢光物質,觀測反應過程中螢光強度的變化情形,文中探討酵素AP-I催化水解螢光性酯類
基質Leu-OCH2CH2NH-Dns(Leu-DEO),Val-OCH2CH2NH-Dns(Val-DEO) 的研究及影響反應速
率的變因,並藉由和先前所作的醯胺類基質做比較,進一步探討酯類和醯胺類水解的反應
機構,以及和文獻中所報導的另一種外生太酵素Carboxypeptidase A (CPA),對酯類和醯
胺類水解的機構做一比較。我們探討基質特異性、酸鹼值、溫度、金屬離子和抑制劑五項
變因對AP-I催化水解酯類基質對反應速率的影響。在基質特異性方面,酵素對於胺基端和
羧基端均具有疏水性基團者,催化活性最好(Leu-DEO>Leu-OMe)。這是因為基質的疏水性
基團可以AP-I活化中心內所包含的疏水袋構形互補,藉以穩定酵素-基質複合物。反應速
率和酵素活性則以胺基端為Leu的基質較大。在金屬離子方面,加入鈣離子可以明顯的增
加酵素AP-I的活性,約為原來 (只含有鋅離子的酵素) 76倍。鍶、鋇次之,鎂離子最少。
在抑制劑方面,加入抑制劑,Leu-NHOH 、Phen-NHOH時Dns的螢光強度Fmax 不變,這是由
於直接激發的螢光強度是和基質濃度成正比,而斜率會隨著抑制劑增加而變小。可以求出
是屬於競爭型抑制作用。其抑制常數分別為0.030±0.001 mM (Leu-NHOH),0.0013±0.00
2 mM(Phen-NHOH)。 由本論文中發現酵素AP-I 對於酯類的水解速率大於醯胺類,鈣離
子的加入對於酯類和醯胺類基質的的活性皆有明顯的變化,對於酯類基質更為明顯,在加
入同一種抑制劑時對兩類基質會有相同的抑制形態生成,由此可以推論酵素AP-I 對於酯
類和醯胺類基質具有相同的反應機構。

AbstractWe use the stopped-flow to study Aminopeptidase I (AP-I), catalyzed hy
drolysis of Leu-DEO、Val-DEO, and investigate the factors that influence the r
ate of the reaction. We observed the existence of a Fluorescent change and det
ermine the rate constant of each step. We have examined five factors including
substrate specificity, pH, temperature, metal ion and inhibitor that influenc
e the rate of this reaction. AP-I prefers for substrates with hydrophobic grou
p at both N-terminal and C-terminal (Leu-DEO > Val-DED > LPNA) suggesting the
existence of a hydrophobic pocket in the active site of the enzyme. The rate o
f enzyme-catalyzed hydrolysis of Leu-DEO is greater (3 fold) than that of Val-
DED, even thought the structure of these two substrates differ only slightly.
This Addition of alkaline earth metal ions (Mg2+, Ca2+, Ba2+, and Sr2+) increa
ses the activity of AP-I with Ca (II) exhibiting the most prominent effects (7
6 fold increase in activity). Addition of Leu-NHOH or Phe-NHOH decreases the F
max value of dansyl fluorescence intensity suggesting that they are competitiv
e inhibitors. The inhibition constants are 0.030±0.001, 0.0013±0.002 mM for
Leu-NHOH and Phe-NHOH respectively.

QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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