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研究生:魏麗真
研究生(外文):Lejean Wei
論文名稱:以梭酸化酵素次單元為標籤之豬胰磷酸脂解酵素的製備與應用
論文名稱(外文):The Preparation and Application of the Truncated Biotinylated Carboxylase Carrier protein(BCCP)-tagged Porcine Pancreatic PhospholipaseA2
指導教授:袁俊傑袁俊傑引用關係
指導教授(外文):Chiun-Jye Yuan
學位類別:碩士
校院名稱:國立交通大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1999
畢業學年度:87
語文別:中文
論文頁數:57
中文關鍵詞:磷酸脂解酵素胰磷酸脂解酵素接受器生物素甲基傳遞蛋白質接合蛋白
外文關鍵詞:Secretory phospholipases A2PLA2-I receptorBCCPFusion protein
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哺乳類中分泌型磷酸脂解酵素(14KDa)大致可依其基本結構分成二型:一種為胰臟分泌的pPLA2-I,另一為關節炎型的pPLA2-II。
近來之研究指出pPLA2-I除了消化方面的功能外,亦可透過接受器調控細胞內許多生理功能。例如誘導細胞的增殖,平滑肌收縮,化學增活作用與受精作用等。
PLA2-I接受器的分布已知是在哺乳動物的腎,胃,胰,肺等組織;而接受器分子量從180-200KDa不等。至於其他組織是否也有此胰磷酸脂解酵素接受器的存在目前並不是很清楚。
為了進一步研究此類接受器在各類組織,細胞,尤其是癌細胞中之分佈,我們建立一個非放射性且簡易的檢測方法,我們採用大腸桿菌醯基合成酵素中的一個次單元:含生物素甲基傳遞蛋白質的(amino acid:80-157) BCCP;(Biotinylated carboxylase carrier protein)作為胰磷酸脂解酵素的標記。我們建構了數個接合蛋白質的表現型質體,為了找出最適於作為標記的生物素接和區域,我們對甲基傳遞蛋白質以分子生物技術作不同程度的截斷(分別為BCCP80-136,BCCP80-144,BCCP80-151及BCCP80-156),並將這些接合蛋白置於大腸桿菌BL21(DE3)中進行大量表現,針對這些蛋白質我們將測試其活性,生物素標記的比率及對胰磷酸脂解酵素受體的親和力。
Mammalian Secretory phospholipases A2(sPLA2,14KDa) are classified into two types : the pancreatic group I(PLA2-I) and the arthristic group II, on the basis of their primary structure.
Recent reports indicate that PLA2-I, in addition to its digestive function, has receptors-mediated effects. For instance, PLA2-I,via its receptor, can induce cell proliferation, airway and vascular smooth muscle contraction, chemokinesis and fertilization.
PLA2-I receptor is present in various kinds of organs, including mammalian stomach, pancreas, spleen and lung . These receptors with molecular masses of 180-200KDa, have been identified in rabbit, rat, mouse, human and bovine tissues.
To elucidate the distribution of PLA2-I receptor in different tissues and cells , especially in cancer cell ,we developed a simple non-radioisotope approach. A truncated Biotin carboxylase carrier protein (BCCPt , a.a.: 80-157) was used as a tag to label PLA2-I by fusing both porcine PLA2-I gene with truncated BCCP fragment cDNA.
To find out the smallest domain of BCCPt that can be still recognized and labeled by biotin ligase , we prepared various pPLA2-I-BCCPt fusion constructs containing different length of BCCP domain, including BCCPt(80-136), BCCPt(80-144), BCCPt(80-151) and BCCPt(80-156).
These expression constructs were over-expressed in E.Coli strain BL21(DE3).
The result showed that PLA2-I-BCCPt could be over expressed in BL21(DE3), although in a form of inclusion body. The biotinylation of all four fusion proteins were observed as detected by Streptavidin-conjugated HRP followed by TMS colorimeteric development.
目錄 頁次
中文摘要………………………………………………………….i
英文摘要………………………………………………………. iii
誌謝………………………………………………………………iv
目錄………………………………………………………………v
圖目錄……………………………………………………………ix
縮寫及符號說明…………………………………………………x
第一章 緒論
第一節 介紹胰磷酸脂解酵素pPLA2-I與生物鹼梭酸化酵素 (BCCP)簡介……………………………………….1
第二節 研究目的………………………………………………..6
第二章 材料與方法
第一節 實驗材料
1.1菌株…………………………………………………………..7
1.2培養基………………………………………………………..7
1.3質體…………………………………………………………..8
1.4引子…………………………………………………………..8
1.5質體純化用試劑……………………………………………..9
1.6 DNA瓊脂糖膠體電泳緩衝液……………………………….9
1.7製備勝任細胞(competent cell)用試劑……………………….10
1.8核酸自動定序用試劑…………………………………………10
1.9酵素……………………………………………………………10
1.10 Gel 純化用試劑組…………………………………………..11
1.11蛋白質純化緩衝液…………………………………………..11
1.12蛋白質膠體電泳分析用試劑………………………………..11
1.13酵素活性分析用試劑……………………………………….13
第二節 儀器
第三節 研究原理與方法
3.1 Biotin carboxylase carrier protein (BCCP)的製備……………15
3.1-1 研究原理……………………………………………………15
3.1-2 方法
(1) Genomic DNA之純化……………………………………….16
(2)聚合酵素連鎖反應(PCR)………………………………….16
(3)DNA片段之純化……………………………………………..17
(4)接合作用Ligation………………………………………….…18
(5)轉形作用Transformation……………………………………..18
(6)小量質體純化………………………………………………...19
(7)酵素消化作用Enzyme digestion……………………………..20
(8)BCCP植入pET-22b質體過程……………………………….21
3.2 第一型胰磷酸脂解酵素(Pancreatic Phospholipase A2-I)的製備
3.2-1研究原理…………………………………………………….25
3.2-2 方法
(1) PCR反應……………………………………………………..25
(2) PCR 產物純化……………………………………………….26
(3) 接合作用…………………………………………………….26
(4) 轉形作用…………………………………………………….26
(5) 小量質體純化……………………………………………….26
(6) 酵素消化作用Enzyme digestion……………………………26
(7) DNA 序列分析…………………………………………….27
(8) DNA片段之純化…………………………………………..27
(9) 接合作用…………………………………………………….27
(10) 酵素消化作用Enzyme digestion…………………………..27
(11) PCR screening……………………………………………..28
3.3 接合性蛋白質表現
3-3.1酵素粗萃取表現…………………………………………….28
3-3.2 Inclusion body之純化………………………………………31
3-3.3酵素活性分析……………………………………………….32
第三章 結果與討論
3-1.1 BCCP作為標誌pPLA2-I之優點……………………………34
3-1.2 BCCP(80-156)片段之討論………………………………….34
3-1.3 pPLA2-I--BCCP 質體之建構與轉型作用…………………35
3-2 酵素之表現…………………………………………………...36
第四章 未來展望
參考文獻………………………………………………………………..41
附錄一以T7terminator為引子之pPLA2-I-BCCP(80-136)核酸序列圖……………………………………………………………….51
附錄二以T7terminator為引子之pPLA2-I-BCCP(80-144)核酸序列圖……………………………………………………………….52
附錄三以T7terminator為引子之pPLA2-I-BCCP(80-151)核酸序列圖……………………………………………………………….53
附錄四以univresal M13為引子之pPLA2-I(T-vector)核酸序列圖……………………………………………………………….54
附錄五以reversal M13為引子之pPLA2-I(T-vector)核酸序列圖………………………………………………………………55
附錄六 pPLA2-I活性曲線圖…………………………………………56
附錄七pPLA2-I受質對螢光變化量圖……………………………….57
圖目錄 頁次
圖一 BCCP整體折疊圖……………………………………………….44
圖二 BCCP主鏈氫鍵結構圖………………………………………….45
圖三 蜂毒中pPLA2-I在膜上作用之方向與機制圖…………………..46
圖四 質體pET-22b(+)圖……………………………………………….47
圖五 質體pUC-T圖譜………………………………………………...48
圖六 pPLA2-I-truncated BCCP PCR screening………………………49
圖七 pPLA2-I-truncated BCCP在不同條件下表現之電泳圖………50
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1. <談我看過的武俠小說> 古龍 聯合月刊 1983.2 頁882-84、1983.3頁74、983.4 頁74、1983.5 頁74-75、1983.6 頁78、1983.7 頁76、1983.8 頁98-99
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4. <怎樣寫武俠小說> 武盲;<我也是江湖人> 古龍 大成 1979.5 頁51-61
5. <怎樣寫武俠小說> 武盲;<我也是江湖人> 古龍 大成 1979.5 頁51-61
6. <中國古代的俠>張英;<武林大俠何處去?>莊練 國文天地 1990.5 頁 13-20
7. <中國古代的俠>張英;<武林大俠何處去?>莊練 國文天地 1990.5 頁 13-20
8. <論蒙汗藥與武俠小說> 王春瑜 中國文化月刊 頁109-119
9. <論蒙汗藥與武俠小說> 王春瑜 中國文化月刊 頁109-119
10. <中西武俠小說之比較> 侯健 聯合文學 1988.1 頁180-18
11. <中西武俠小說之比較> 侯健 聯合文學 1988.1 頁180-18
12. <從「通俗」的角度談武俠小說> 林保淳 文訊月刊 1986.10 頁125-132
13. <從「通俗」的角度談武俠小說> 林保淳 文訊月刊 1986.10 頁125-132
14. <鴛鴦蝴蝶與武俠小說> 龔鵬程 聯合文學 1986.9 頁24-28
15. <鴛鴦蝴蝶與武俠小說> 龔鵬程 聯合文學 1986.9 頁24-28
 
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