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研究生:梁義林
研究生(外文):I.L. Liang
論文名稱:以天然交聯劑(Genipin)交聯生物組織材料最適化條件及其穩定性的探討
指導教授:宋信文
指導教授(外文):H.W. Sung
學位類別:碩士
校院名稱:國立中央大學
系所名稱:化學工程研究所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:1999
畢業學年度:87
語文別:中文
論文頁數:72
中文關鍵詞:穩定性生物組織最適化條件反應機制Genipin
外文關鍵詞:GenipinStabilityBiological TissueOptimizationMechanism
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摘要
生物組織常被用來當做製造人工器官的材料,然而這些生物組織材料在植入人體之前,都必須先經過交聯劑的交聯處理,以增加其穩定性及抵抗人體內免疫系統與酵素的攻擊。目前臨床上最常使用的生物組織交聯劑為glutaraldehyde,但其細胞毒性相當的高,使得植入體內的glutaraldehyde交聯材料引起強烈且持續性的免疫反應。另外,由於glutaraldehyde交聯反應產生的Schiff base鍵結並不穩定,可能會導致交聯後的生物組織材料有降解的現象。為了克服這些問題,我們著手使用了一種從中藥梔子果實裡萃取出來的天然交聯劑(genipin),來交聯處理生物組織材料。
本研究分成兩部份。第一部份的研究目的,是在探討於不同交聯反應條件下,genipin交聯處理的生物組織的交聯性質與反應前後genipin的濃度變化,以找出genipin與生物組織交聯反應的最適化條件。另外,我們也探討了genipin與生物組織的交聯反應機制。實驗結果顯示,在低溫(4℃)下, genipin與生物組織的交聯反應速率較慢且交聯程度較低。在genipin維持過量的情況下,以不同濃度genipin溶液交聯處理3天後的生物組織交聯性質,並沒有明顯的差異。另外,在中性(pH 7.4)的環境下,genipin交聯處理的生物組織交聯性質較好,鹼性(pH 10.5)次之,酸性(pH 4.0)則較差。
當水中存有自由胺基(-NH2)或是氫氧根離子(OH-)時,這些富含自由電子對的官能基會對genipin做親核攻擊,使得genipin開環形成醛基,而開環後的genipin再以其醛基與生物組織上的胺基產生鍵結,進而達到交聯生物組織的效果。在酸性的環境中,氫離子濃度較高,使得生物組織內的自由胺基上的自由電子對被遮蔽,進而妨礙了genipin與自由胺基的結合。因此在酸性的環境中,genipin交聯處理的生物組織交聯性質較差。另外,由於在鹼性的環境下,genipin開環後會自行產生聚合反應,使得其濃度下降。因此genipin在鹼性環境下,交聯處理的生物組織交聯程度,要比在中性環境下來的略低。
本研究的第二部份探討了以genipin交聯處理的生物組織,在經過長時間的保存後,其交聯性質以及機械性質的穩定性。另外,我們也以體外細胞培養的方式,分別測試保存組織及其保存液,在長時間的保存過程中是否會產生有毒物質。實驗裡,我們的對照組為glutaraldehyde交聯處理的生物組織。實驗結果顯示,經過長時間保存後,genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織的交聯性質都有些許下降的趨勢。下降現象發生的時間以glutaraldehyde 交聯處理的生物組織較早,且下降的趨勢也較為明顯。造成這個現象可能的原因是glutaraldehyde與生物組織上的自由胺基交聯結構為Schiff base鍵結,此鍵結並不穩定,經過水解之後,又會還原成醛基與自由胺基。相對的,genipin與生物組織上的自由胺基反應後,則會生成雜環結構的3級胺,其鍵結較為穩定。所以經過長時間的保存後,各項交聯性質的測試結果,都是以genipin交聯處理的生物組織組織較為穩定。
但是genipin與glutaraldehyde 交聯處理的生物組織經過長時間保存後,其抗張應力與韌性皆沒有明顯的改變。而在細胞毒性的測試結果方面,genipin交聯處理的生物組織及其保存液在長時間保存過程中,並沒有細胞毒性的產生。而glutaraldehyde 交聯處理的生物組織內有毒物質,在保存的過程中會慢慢釋放到保存液中,使得保存組織本身毒性減少,保存液毒性增加。
綜合以上的實驗結果,genipin比glutaraldehyde要適合用來做為臨床上的生物組織材料交聯劑。
目錄
內容 頁數
摘要I
目錄III
圖索引V
第一章 緒論
1.1 生物組織材料1
1.2 交聯劑1
1.3 研究動機與目的2
第二章 以Genipin交聯處理生物組織反應最適化條件的探討
2.1 研究目的4
2.2 材料與方法4
2.2-1組織試片的製備4
2.2-2研究方法6
2.3 結果與討論11
2.3-1反應時間的影響11
2.3-2反應溫度的影響----------------------------------------------15
2.3-3 Genipin濃度的影響-------------------------------------------19
2.3-4反應pH值的影響---------------------------------------------23
2.3-4反應機制--------------------------------------------------------28
第三章 以Genipin交聯處理的生物組織穩定性質探討
3.1 研究目的47
3.2 材料與方法47
3.2-1組織試片的製備47
3.2-2機械性質測試48
3.2-3細胞毒性測試----------------------------------------------------51
3.3 結果與討論54
參考文獻70
圖索引
圖 頁數
圖2-1、豬心包膜交聯前之處理流程圖5
圖2-2、Glutaraldehyde與genipin的分子結構式5
圖2-3、Ninhydrin與自由胺基的反應機制示意圖7
圖2-4、生物組織內自由胺基被crosslinking
與masking的示意圖11
圖2-5、生物組織在交聯前(fresh)以及經genipin(GP)或
glutaraldehyde(GA)交聯處理後交聯指數時間曲線圖比較12
圖2-6、生物組織在交聯前(fresh)以及經genipin(GP)或
glutaraldehyde(GA)交聯處理後變性溫度時間曲線圖比較13
圖2-7、生物組織在交聯前(fresh)以及經genipin(GP)或 glutaraldehyde(GA)交聯處理後水含量時間曲線圖比較14
圖2-8、不同溫度下與生物組織反應3天後genipin溶液濃度的變化-15
圖2-9、不同保存溫度下genipin溶液本身的濃度變化時間曲線圖16
圖2-10、不同反應溫度下genipin交聯處理的生物組織交聯指數比較17
圖2-11、不同反應溫度下genipin交聯處理的生物組織變性溫度比17
圖2-12、不同反應溫度下genipin交聯處理的生物組織水含量比較18
圖2-13、不同起始濃度的genipin溶液與生物組織反應3天後的濃度
變化20
圖2-14、不同起始濃度的genipin溶液本身的濃度變化時間曲線圖20
圖2-15、不同濃度genipin溶液交聯處理的生物組織交聯指數比較21
圖2-16、不同濃度genipin溶液交聯處理的生物組織變性溫度比較22
圖2-17、不同濃度genipin溶液交聯處理的生物組織水含量比較22
圖2-18、不同pH值的genipin溶液與生物組織反應3天後其濃度的
變化情形----------------------------------------------------------------23
圖2-19、不同pH值的genipin溶液本身的濃度變化時間曲線圖24
圖2-20、不同pH值的genipin溶液交聯處理的生物組織交聯指數比較25
圖2-21、不同pH值的genipin溶液交聯處理的生物組織變性溫度比較
26
圖2-22、不同pH值的genipin溶液交聯處理的生物組織水含量比較
---------------------------------------------------------------------------27
圖2-23、Genipin在水中開環假設反應機制28
圖2-24、Genipin結晶粉末的FTIR吸收圖譜29
圖2-25、醛基與多倫試劑以及斐林試劑的反應示意圖30
圖2-26、Genipin(GP)與glutaraldehyde(GA)的多倫試劑測試結果30
圖2-27、Genipin(GP)與glutaraldehyde(GA)的斐林試劑測試結果31
圖2-28、Genipin溶解在D2O中的NMR氫譜吸收光譜32
圖2-29、Genipin溶解在D2O中的NMR碳譜吸收光譜33
圖2-30、Genipin與Methylamine反應機制假設示意圖------------------34
圖2-31、啶(pyridine)分子結構式-------------------------------------------34
圖2-32、1,6-Hexanediamine分子結構式-------------------------------------35
圖2-33、Genipin與1,6-Hexanediamine反應生成藍色產物的
紫外光/可見光吸收光譜----------------------------------------------35
圖2-34、Genipin與1,6-Hexanediamine反應生成藍色產物的FTIR
吸收圖譜-----------------------------------------------------------------37
圖2-35、Genipin與1,6-Hexanediamine在低溫(10℃)下反應的NMR
氫譜吸收圖譜-----------------------------------------------------------38
圖2-36、Genipin結構示意圖----------------------------------------------------39
圖2-37、Genipin與氫氧化鈉溶解在D2O中並在低溫(10℃)下的NMR
氫譜吸收圖譜-----------------------------------------------------------42
圖2-38、Genipin與氫氧化鈉溶解在D2O中並在低溫(10℃)下的NMR
氫譜吸收圖譜-----------------------------------------------------------43
圖2-39、醛基的聚合反應示意圖-----------------------------------------------44
圖2-40、PEG標準品的滯留時間對分子量標準曲線半對數圖---------45
圖2-41、鹼性genipin水溶液的GPC膠質過濾層析圖譜----------------46
圖3-1、組織試片滅菌保存流程圖--------------------------------------------48
圖3-2、一般生物組織材料的應力-應變行為曲線圖-------------------49
圖3-3、測試組織之試片之幾何構形50
圖3-4、材料測試機示意圖50
圖3-5、生物組織試片SEM前處理步驟51
圖3-6、保存組織細胞毒性測試流程圖52
圖3-7、保存液細胞毒性測試流程圖53
圖3-8、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織在長時間
保存過程中交聯指數的比較54
圖3-9、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織在長時間
保存過程中變性溫度的比較----------------------------------------55
圖3-10、醛基與自由胺基反應示意圖56
圖3-11、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織在長時間
保存過程中抗張應力的比較----------------------------------------57
圖3-12、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織在長時間
保存過程中韌性的比較----------------------------------------------55
圖3-13、Genipin交聯處理的生物組織保存1天後的細胞毒性
測試結果58
圖3-14、Glutaraldehyde交聯處理的生物組織保存1天後的細胞毒性
測試結果59
圖3-15、Genipin交聯處理的生物組織保存6個月後的細胞毒性
測試結果59
圖3-16、Glutaraldehyde交聯處理的生物組織6個月後的細胞毒性
測試結果60
圖3-17、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織在長時間
保存過程中其細胞毒性MTT Assay的比較---------------------61
圖3-18、Genipin與glutaralddehyde交聯處理的生物組織在保存
1天後其SEM表面形態觀察結果62
圖3-19、Genipin與glutaralddehyde交聯處理的生物組織在保存
6個月後其SEM表面形態觀察結果62
圖3-20、Genipin交聯處理的生物組織保存液在保存1天後的
細胞毒性測試結果64
圖3-21、Glutaraldehyde交聯處理的生物組織保存液在保存1天後的
細胞毒性測試結果64
圖3-22、Genipin交聯處理的生物組織保存液在保存6個月後的
細胞毒性測試結果65
圖3-23、Glutaraldehyde交聯處理的生物組織保存液在6個月後的
細胞毒性測試結果65
圖3-24、Genipin與glutaraldehyde交聯處理的生物組織保存液在
長時間保存過程中其細胞毒性MTT Assay的比較------------65
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